Microscopi e tecniche di fluorescenza

Preparazione dei vetrini istologici

Quando facciamo istologia, prendo un campione e lo osservo con metodi standard (non fluorescenza con me per organelli e cellule). Per preparare ed osservare un vetrino devo fare:

Fasi della preparazione

• Il prelievo: se taglio un pezzo di tessuto e devo osservarlo nello stato in cui è, devo conservarlo e non farlo degenerare (il campione va fissato con la fissazione — blocca la funzione di enzimi litici dei lisosomi).
• Fissazione: blocco dell’azione degli enzimi litici. Quando si taglia un tessuto si danneggiano anche le cellule e si attivano i lisosomi che rilasciano enzimi litici (che tagliano) — gli enzimi lisosomiali distruggono le membrane e vengono rilasciati dalle cellule danneggiate dal taglio del tessuto, questi enzimi andranno a rompere anche le altre cellule. Come blocco l’azione di questi enzimi?
  • Fissativi coagulanti (es. etanolo, acido acetico), coagula le proteine ammassandole tutte insieme (l’enzima viene ammassato insieme alle altre proteine) — ha un difetto: crea agglomerati di proteine che prima, nel tessuto sano, non c’erano e le vedo al microscopio elettronico.
  • Fissativi non-coagulanti (es. formaldeide, glutaraldeide, OsO₄) — più raffinati, nella cellula ci sono proteine ed ogni tanto un enzima lisosomiale. Funge come una specie di colla, sono delle molecole che formano dei ponti (hanno parti reattive alle loro estremità che si legano a proteine formando delle reti — blocco le proteine in quella configurazione senza coagulare). Nel reticolo le proteine non si muovono più.
• Inclusione: includere il tessuto in un mezzo più duro (es. paraffina, resine epossidiche) per consentire il sezionamento in fette di 5-10 µm di spessore. La cera (paraffina) è un materiale idrofobo ed a temperatura ambiente è solido. Si deve compenetrare il tessuto (senza cambiarne le caratteristiche) con questo materiale che a temperatura sarà duro e darà durezza anche al tessuto rendendolo facilmente affettabile. Per il microscopio elettronico si va nell’ordine dei 50/100 nm ed utilizzo delle resine epossidiche (materiale vetroso) che danno una maggiore durezza al campione.
• Taglio: microtomo — produrre fettine sottili del campione da 2 a 10 micron (la luce deve attraversare il campione per vederlo sul microscopio). Alcuni tessuti sono difficili da tagliare sottilmente perché mollicci (si ricorre all’inclusione). Il microtomo è lo strumento che taglia a fette di micrometri.
• Colorazione: per produrre contrasto delle strutture da osservare (le fettine sottilissime sono quasi trasparenti e non hanno contrasto).
• Montaggio: montare la fettina sul vetrino portaoggetti e mettere sopra di esso un coprioggetti più sottile.

Inclusione in paraffina

Poiché il tessuto è pieno d’acqua e la paraffina non si mischia con l’acqua, devo sostituire prima l’acqua con qualcosa che possa sciogliere la paraffina. Attuo una disidratazione del tessuto attraverso l’utilizzo di una serie crescente di alcool — prendo una soluzione di alcool ed acqua al 50% e poi salgo fino all’alcool assoluto. Così l’acqua va a diminuire. Questa operazione va a modificare la composizione del tessuto dopo che l’alcool è penetrato poiché vede scambiarsi l’acqua con l’etanolo.

Non faccio un passaggio diretto mettendo subito il tessuto in alcool puro perché avrei uno shock eccessivo (velocità a cui avviene lo scambio tra acqua e alcool sarebbe troppo veloce e comporterebbe delle deformazioni del tessuto). La struttura così viene fissata. Tutta l’acqua è stata sostituita con l’etanolo che non è ancora un solvente della paraffina — ci vuole un solvente organico più forte che è lo xilolo o xilene (scinde sia l’etanolo che la paraffina). Sposto i vetrini dall’etanolo allo xilolo e scambio i due solventi, a questo punto al posto dell’etanolo va lo xilolo che compenetra tutto il campione. In questo caso la paraffina si può sciogliere. Viene utilizzato prima l’etanolo perché è più affine all’acqua e si estrae meglio l’acqua utilizzando l’etanolo (lo xilolo non lo farebbe bene).

Sciolgo la paraffina che diventa liquida, immergo il mio campione in essa e la paraffina si mischia con lo xilolo (entrambi sono liquidi). Quando passo in xilolo, siccome esso ha un indice di rifrazione dei tessuti, il tessuto risulta trasparente quando è mischiato con esso: il tessuto diventa diafano — da qui processo di diafanizzazione (passaggio da etanolo a xilolo). Prendo il campione in xilolo e lo metto in una vaschettina (stufa a 65 gradi dove la paraffina rimane allo stato liquido). Tengo il campione delle ore nella stufa in paraffina liquida ed il liquido nel frattempo si mescola nel tessuto. Una volta posto a temperatura ambiente la paraffina solidifica e quindi abbiamo realizzato il campione indurito, pronto per essere tagliato con il microtomo. Il microtomo ha una lama ed una leva che oscilla su e giù. La manovella mi consente di far scivolare la leva e taglia le fettine di 10 micron.

Una volta tagliato dobbiamo colorare i campioni tagliati — siccome quasi tutti i coloranti (ematossilina…) sono idrosolubili (stanno in soluzione acquatica) e devo fare tutti i passaggi al contrario: devo togliere la paraffina perché è impermeabile (cerata) — faccio la spara natura e la reidratazione. La fettina dato che è sottile basta immergerla in xilolo (solvente della paraffina) e questo lava via la paraffina sul tessuto. Poi sostituisco lo xilolo con l’etanolo che aiuta a reidratare il campione (passando da soluzione pura al 100% gradualmente fino al 50% ed infine in acqua. Ora che il campione è reidratato si effettua la colorazione — in ematossilina o miosina.

Per montare il vetrino devo usare una resina, una colla trasparente per attaccare i vetrini (balsamo del Canada) che non è solubile in acqua ma è solubile in xilolo — sempre gradualmente disidrato e inserisco alcool fino ad avere di nuovo xilolo all’interno del tessuto.

Queste cose però potrebbero compromettere la cellula e non farci fare l’immunoistochimica — se la proteina è sepolta in un coagulo insieme ad altre non viene riconosciuta dagli anticorpi. Posso usare un altro metodo per fissare un campione — congelarlo (faccio un congelamento istantaneo in azoto o elio liquido che hanno temperature di 200 gradi sotto zero, l’acqua così non ha il tempo di assestarsi nel reticolo cristallino e congela istantaneamente — viene bloccata in uno stato vetroso e non aumenta di volume, vitrificazione dell’acqua). Non posso mettere un pezzo di tessuto in freezer ed aspettare che congeli perché se lo faccio l'acqua si raffredda piano piano e si organizza in un reticolo cristallino che fa occupare più spazio all’acqua (spacca la cellula).

Il congelamento fa la fissazione (blocca gli enzimi litici) ed indurisce il campione (si taglia con un microtomo particolare che taglia a temperature sotto zero — criostato o microtomo congelatore, sennò mentre lo taglio inizia a sciogliersi). In questo modo ho solo congelato l'acqua al suo interno e posso attuare l’immunoistochimica perché conserva le proteine al suo interno — posso anche combinare la colorazione all'immunoistochimica.

Colorazione dei campioni

Una volta fatte queste operazioni dobbiamo colorare il campione usando la coppia ematossilina e miosina (combinazione di coloranti acidi e coloranti basici). Ematossilina ed eosina — combinazione di un colorante acido e un colorante basico.

Caratteristiche dei coloranti

Coloranti basici

Sono carichi positivamente e si legano a sostanze anioniche (basofile). Gli acidi nella cellula possono essere gli acidi nucleici, i coloranti basici si accumulano nel nucleo perché lì trovano capacità di interazione elettronica. Quando immergo il tessuto nell’ematossilina (basica) nel citoplasma non trova cariche negative e non si ferma lì (quando si sciacqua il vetrino il colorante è trattenuto nel nucleo e va via dal citoplasma). Si legano ai nuclei, al nucleolo e sostanze basofile (tutto quello che nella cellula capta il colorante basico è basofilo) come il reticolo endoplasmatico ruvido perché contiene i ribosomi che sono fatti di acidi nucleici e sono negativi.

Questi rosa sono enterociti (come i villi) e sono colorati solo con ematossilina (violacea). Alcuni coloranti come la toluidina fanno la metacromasia (cambiamento del colore) — quando guardo il tessuto lo vedo viola anche se ho inserito il colorante blu. Non accade per tutti i tipi di tessuto, alcuni componenti di tessuto sono metacromatiche ed altre sono ortocromatiche (che non cambiano colore e rimangono blu). La metacromasia è dovuta a fenomeni di assorbimento ed emissioni della luce da parte della molecola — molecole vicino si influenzano l'una con l’altra e questa influenza si manifesta con un cambiamento di colori. Quando le molecole di blu toluidina si dispongono in fila in modo ordinato e cambiano colore. Questo dice già qualcosa riguardo al tipo di tessuto. Ci sono cellule mucipare caliciformi (nella cartilagine), che secernono muco, il muco è formato da carboidrati che possono dar luogo a metacromasia (in questo caso la mucina, prodotta da queste cellule attua la metacromasia). Nella cellula il nucleo che è basofilo attira il blu di toluidina, ma il DNA (anche se è negativo) non dà metacromasia poiché non le dispone in modo impilato. Il nucleo è ortocromatico e il muco è metacromatico.

Coloranti acidi

Sono carichi negativamente e si legano a sostanze cationiche (acidofile), va ad interagire con molecole positive della cellula. Si usa sempre insieme un colorante acido ed uno basico su un campione perché così si creano colori diversi in diverse parti della cellula. L’eosina è rosa. Vanno a colorare il citoplasma (leggermente acidofilo), ma ci sono delle molecole che hanno un'elevata affinità per l’eosina perché sono cationiche come la cheratina (negli epiteli), le miofibrille (nei muscoli) ed il collagene (tessuti connettivi). A seconda di come queste proteine si organizzano vedremo un rosa diverso da un altro, ma dalla colorazione rosa capiremo cose del muscolo.