Microscopi e tecniche di fluorescenza

PREPARAZIONE DEI VETRINI ISTOLOGICI

Quando facciamo istologia, prendo un campione e lo osservo con metodi standard (non uorescenza con me per

organelli e cellule).

Per preparare ed osservare un veterino devo fare :

- il prelievo — se taglio un pezzo di tessuto e devo osservarlo nello stato in qui è, devo conservarlo

e non farlo degenerare (il campione va ssato con la ssazione — blocca la funzione di enzimi litici

dei lisosomi).

- Fissazione: blocco dell’azione degli enzimi litici. Quando si taglia un tessuto si danneggiano anche

le cellule e si attivano i lisosomi che rilasciano enzimi litici (che tagliano) — gli enzimi lisosomiali

distruggono le membrane e vengono rilasciati dalle Cellule danneggiate dal taglio del tessuto,

questi enzimi andranno a rompere anche le altre cellule. Come blocco l’azione di questi enzimi?

1. Fissativi coagulanti (es. etanolo, acido acetico), coagula le proteine ammassandole tutte

insieme (l’enzima viene ammassato insieme alle altre proteine)—ha un difetto: crea

agglomerati di proteine che prima, nel tessuto sano, non c’erano e le vedo al microscopio

elettronico.

2. Fissativi non-coagulanti (es. formaldeide, glutaraldeide, OsO4)—più ra nati, nella cellula

ci sono proteine ed ogni tanto un enzima lisosomiale. Funge come una specie di colla,

sono delle molecole che formano dei ponti (hanno parti reattive alle loro estremità che si

legano a proteine formando delle reti— blocco le proteine in quella con gurazione senza

coagulare). Nel reticolo le proteine non si muovono più.

- • Inclusione: includere il tessuto in un mezzo più duro (es. para na, resine epossidiche) per

consentire il sezionamento in fette di 5-10 µm di spessore. La cera (para na) è un materiale

idrofobo ed a temperatura ambiente è solido. Si deve compenetrare il tessuto (senza cambiarne le

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caratteristiche) con questo materiale che a temperatura sarà duro e darà durezza anche al tessuto

rendendolo facilmente a ettabile.

Per il microscopio elettronico si va nell’ordine dei 50/100 nm ed utilizzo delle resine epossidiche

(materiale vetroso) che danno una maggiore durezza al campione.

- • Taglio: microtomo — produrre fettine sottili del campione da 2 a 10 micron (la luce deve

attraversare il campione per vederlo sul microscopio). Alcuni tessuti sono di cili da tagliare

sottilmente perché mollicci (si ricorre all’inclusione). Microtomo è lo strumento che taglia a fette

di micrometri.

- • Colorazione: per produrre contrasto delle strutture da osservare (le fettine sottilissime sono

quasi trasparenti e non hanno contrasto).

- • Montaggio — montare la fettina sul vetrino portaoggetti e mettere sopra di esso un copri

oggetti più sottile.

INCLUSIONE IN PARAFFINA

poichè il tessuto è pieno d’acqua e la

para na non si mischia con l’acqua, devo

sostituire prima l’acqua con qualcosa che

possa sciogliere la para na

Attuo una disidratazione del tessuto

attraverso l’utilizzo di una serie crescente

di alcool — prendo una soluzione di

alcool ed acqua al 50% e poi sale no

all’alcool assoluto. Così l’aqua va a

diminuire. Questa operazione va a

modi care la composizione del tessuto

dopo che l’alcool è penetrato poiché vede

scambiarsi l’acqua con l’etanolo.

Non faccio un passaggio diretto mettendo subito il tessuto in alcool puro perché avrei uno shock eccessivo

(velocità a cui avviene lo scambio ta acqua e alcool sarebbe troppo veloce e comporterebbe delle

deformazioni del tessuto). La struttura così viene ssata.

Tutta l’acqua è stata sostituita con l’etanolo che non è ancora un solvente della para na—ci vuole un

solvente organico più forte che è lo xilolo o xilene (scinde sia l’etanolo che la para na). Sposto i vetrini

dall’etanolo allo xilolo e scambio i due solventi, a questo punto al posto dell’etanolo va lo xilolo che

compenetra tutto il campione. In questo caso la para na si può sciogliere. Viene utilizzato prima l’etanolo

perché è più a ne all’acqua e si estrae meglio l’aqua utilizzando l’etanolo (lo xilolo non lo farebbe bene).

Sciolgo la para na che diventa liquida, immergo il mio campione in essa e la para na si mischia con lo

xilolo (entrambi sono liquidi). 24

Quando passo in xilolo, siccome esso ha un’indice di rifrazione dei tessuti, il tessuto risulta trasparente

quando è mischiato con esso: il tessuto diventa diafano — da qui processo di diafanizzazzione (passaggio

da etanolo a xilolo).

Prendo il campione in xilolo e lo metto in una vaschettina (stufa a 65 gradi dove la para na rimane allo

stato liquido). Tengo il campione delle ore nella stufa in para na liquida ed il liquido nel frattempo si

mescola nel tessuto.

Una volta posto a temperatura ambiente la para na solidi ca e quindi abbiamo realizzato il campione

indurito, prodonto per essere tagliato con il microtomo.

Il microtomo ha una lama ed una leva che oscilla su e giù. La manovella mi consente di far scivolare la leva

e taglia le fettine di 10 micron.

Una volta tagliato dobbiamo colorare i campioni tagliati — siccome quasi tutti i coloranti (ematossilina…)

sono idrosolubili (stanno in soluzione acquatica) e devo fare tutti i passaggi al contrario:

- devo togliere la para na perché è impermeabile (cerata)— faccio la spara natura e la

reidratazione.

La fettina dato che è sottile basta

immergerla in xilolo (solvente della

para na) e questo lava via la para na sul

tessuto. Poi sostituisca lo xilolo con

l’etanolo che aiuta a reidratare il

campione ( passando da soluzione pura al

100% gradualmente no al 50% ed in ne

in acqua.

Ora che il campione è reidratato si

e ettua la colorazione — in ematossilina

o miosina

Per montare il vetrino devo usare una

resina, una colla trasparente per attaccare

i vetrini (balsamo del Canada) che non è

solubile in acqua ma è solubile xilolo — sempre gradualmente disidrato e inserisco alcool no ad avere di

nuovo xilolo all’interno del tessuto.

Queste cose però potrebbero compromettere la cellula e non farci fare l’immunoistochimica — se la

proteina è sepolta in un coagulo insieme ad altre non viene riconosciuta dagli anticorpi.

Posso usare un altro metodo per ssare un campione — congelarlo (faccio un congelamento istantaneo

in azoto o elio liquido che hanno temperature di 200 gradi sotto zero, l’acqua così non ha il tempo di

assestarsi nel reticolo cristallino e congela istantaneamente — viene bloccata in uno stato vetroso e non

aumenta di volume, vitri cazione del’acqua). Non posso mettere un pezzo di tessuto in freezer ed

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aspettare che congeli perchè se lo faccio l'acqua si ra redda piano piano e si organizza in un reticolo

cristallino che fa occupare più spazio all’acqua (spacca la cellula).

il congelamento fa la ssazione (blocca gli enzimi litici) ed indurisce il campione (si taglia con un

microtomo particolare che taglia a temperature sotto zero — criostato o microtomo congelatore, sennò

mentre lo taglio inizia a sciogliersi).

in questo modo ho solo congelato l'acqua al suo interno e posso attuare l’immunoistochimica perché

conserva le proteine al suo interno — posso anche combinare la colorazione all'immunoistochimica.

Una volta fatte queste operazioni dobbiamo colorare il campione usando la coppia ematossilina e miosina

(combinazione di coloranti acidi e coloranti basici). Ematossilina ed eosina — combinazione di un

colorante acido e un colorante basico.

Acido tende a rilasciare ioni H+ in acqua (si dissocia nei suoi ioni e rilascia protoni) ed hanno carica

negativa in acqua, la base tende ad acquistare ioni H+ ed hanno carica positiva in acqua (andranno a

reagire con gli anioni, molecole cariche negativamente). Il colorante in acqua si presenta

AH —>A- + H+ (acido)

B + H+ —>BH+ (base)

COLORANTI BASICI

Sono carichi positivamente e si legano a sostanze anioniche (baso le). Gli acidi nella cellula possono essere

gli acidi nucleici, i coloranti basici si accumulano nel nucleo perché lì trovano capacità di interazione

elettronica. Quando immergo il tessuto nell’ematossilina(basica) nel citoplasma non trova cariche negative

e non si ferma lì (quando si sciacqua il vetrino il colorante è trattenuto nel nucleo e va via dal citoplasma)

Si legano ai nuclei, il nucleolo e sostanze baso le

(tutto quello che nella cellula capta il colorante

basico è baso lo) come il reticolo endoplasmatico

ruvido perché contiene i ribosomi che sono fatti di acidi

nucleici e sono negativi)

Questi rosa sono enterociti (come i villi) e sono colorati solo con ematossilina (violacea).

Alcuni coloranti come la toluidina fanno la metacromasia (Cambiamento del colore)— quando guardo il

tessuto lo vedo viola anche se ho inserito il colorante blu. Non accade per tutti i tipi di tessuto, alcuni

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componenti di tessuto sono metacromatiche ed altre sono ortocromatiche (che non cambiano colore e

rimangono blu).

La metacromasia è dovuta a fenomeni di assorbimento ed emissioni della luce da

parte della molecola — molecole vicino si in uenzano l'una con l’altra e questa

in uenza si manifesta con un cambiamento di colori. Quando le molecole di blu

toluidina si dispongono in la in modo ordinato e cambiano colore.

Questo dice già qualcosa riguardo al tipo di tessuto. Ci sono cellule mucipare

caliciformi(nella cartilagine), che si cedono muco, il muco è formato da

carboidrati che possono dar luogo a

metacromasia (in questo caso la mucina,

prodotta da queste cellule attua la

metacromasia). Nella cellula il nucleo che è

baso lo attira il blu di toluidina, ma il DNA

(anche se è negativo) non dà metacromasia

poiché non le dispone in modo impilato. Il

nucleo è ortocromatico e il muco è

metacromatico.

COLORANTI ACIDI

Sono carichi negativamente e si legano a sostanze cationiche (acido le), va ad interagire con molecole

positive della cellula. si usa sempre insieme un colorante acido ed uno basico su un campione perchè così si

creano colori diversi in diverse parti della cellula. l’eosina è rosa. vanno a colorare il citoplasma

(leggermente acido lo), ma ci sono delle molecole che

hanno un'elevata a nità per l’eosina perchè sono

cationiche come la cheratina (negli epiteli), le

mio brille (nei muscoli) ed il collagene (tessuti

connettivi).

a seconda di come queste proteine si organizzano

vedremo un rosa diverso da un altro, ma dalla

colorazione rosa capiremo cose del muscolo.