Appunti di Introduzione alle Tecniche di laboratorio

Analisi del dicroismo circolare nel near UVA

Avremo: X X X X+ + + = 1. Varieremo iterativamente i termini X, X, X e X() fino a quando θβαrc t totalerc tβαsia quanto più possibile vicino a θ. Idealmente lo fare per l'intervallo di λ più ampio sperimentale possibile (es. 175-250nm ma tipicamente 185, 190-250nm).

Posso ricostruire lo spettro misurato come combinazione di spettri di polipeptidi struttura secondaria nota, oppure con gli spettri di proteina a struttura secondaria nota, utilizzando diversi algoritmi. Dall'applicazione di questi programmi otteniamo una tabella che ci dice la percentuale di contributo delle varie strutture nella proteina.

Esempi di applicazioni di dicroismo circolare nel near UVA differenza di quanto abbiamo visto nel far UV, usiamo i range del near UV per studi di struttura terziaria. Vediamo chiaramente il picco di assorbimento dei residui aromatici rispetto che dei legami peptidici. Quando parliamo di near UV, arriviamo da 250-350nm.

segnale associato alla presenza di proteinein questo range è molto più debole: lo spettro assume valori bassissimi.

La stessa cosa vediamo in quest'immagine. I tre diversi residui hanno spettri di assorbimentodifferente, a come varia lo spettro di dicroismo circolare? Presentano segnali differenti, la fenilalaninacopre un range di 250-265nm, per esempio. Tuttavia non ci permette di apprezzare le concentrazionialle quali si trovano queste componenti.

Qui un altro peptide: riconosciamo il segnale dei tre residui, che sono in rapporti ben diversi, ma nondeducibili dallo spettro di assorbimento. Il residuo è in grado di assorbire, ma i suoi dintorniassorbono differentemente luce polarizzata a destra o da sinistra, dipende fortemente quindidall'intorno che ha. Possiamo stilare un intorno chiaro di riferimento, permettendo analisiconformazionali tramite spettro nel near UV? Con il range del far UV possiamo fare studi sullastruttura secondaria, possiamo fare

le caratteristiche generali del fold proteico.variazioni del profilo:vediamo come in base al range di temperature, possiamo osservare lo spettro della proteina.Vediamo come dopo il passaggio a 80 abbiamo una grande denaturazione, lo cogliamo dall'appiattimento del grafico, ma non possiamo capire cosa si sta denaturando, se un β-barrel o se un'α-globulina. Usiamo questa analisi per capire a che agenti e condizioni denaturanti risponde la mia proteina.Quanto influenza un gruppo prostetico nello studio CD?Qui vediamo una proteina oligomerica batterica, WrbA, a cui si associa un gruppo prostetico flavinamonoucletidica, a formare una struttura tetramerica, che si trova nella porzione equatoriale della molecola.La perdita del gruppo prostetico causa perdita del fold, in maniera irreversibile.L'assorbimento ottico, nella regione del visibile, mostra il profilo visto sopra, vediamo bene due picchi. Se facciamo lo spettro CD della molecola in forma pura, vediamo tutto piatto (spettro CD giallo). In assenza del gruppo

prostetico (in blu) nulla sembra cambiare; con il gruppo prostetico associato alla proteina (in rosso) notiamo grandi differenze: il segnale viene indotto, la sua presenza dipende dal contesto che si genera quando il gruppo prostetico reagisce con la proteina: due elementi invisibili allo studio, se indotto nel legame, permettono di essere visionati allo strumento.

La denaturazione termica della proteina può essere colta soltanto se questa si trova in forma nativa, in quanto appena alziamo la temperatura vengono meno le interazioni tra proteina e gruppo prostetico.

Queste analisi si possono fare anche sugli acidi nucleici: il DNA esiste in due conformazioni B, quello classico, A, che si associa a complessi, oppure Z. Possiamo analizzare la struttura del DNA tramite spettri di DNA: dandoci una conformazione complessiva; possiamo includere regioni del far e near UV, inoltre verificare passaggi dalla conformazione A → B; il segnale è espresso in relazione al

Δε.Per concludere:
22 Lezione di Tecniche di Laboratorio, di Lorenzo Di Palmaa

La fluorescenza
Riprendiamo uno schema di assorbanza ed emissione:ci muoviamo anche nella fluorescenza in una regione precisa: tra visibile ed UV, noi vogliamomisurare le interazioni tra la radiazione e la materia. Noi saggiamo il comportamento delle proteinequando eccitate, ma non vogliamo chiaramente intaccare la loro struttura e composizione.
L'eccitazione è associata all'assorbimento di un quanto di energia, mentre la fluorescenza è derivante dall'emissione, dallo scaricamento di quest'energia in eccesso. Vogliamo evitare fenomeni dissipativi, come la produzione di calore.
Dobbiamo poter misurare le radiazioni, purché queste avvengano ad ua data velocità e lunghezza d'onda rilevabile. Questo schema rappresenta l'assorbimento: una radiazione eccita un elettrone. L'energia è esprimibile come prodotto . La fluorescenza

è causata dal passaggio di⋅ h v’eccitazione, alla materia basale, con una nuova radiazione emessa, , in quanto la⋅seconda radiazione, quella emessa, avrà una frequenza differente. In casi che non siverificano praticamente mai, la radiazione emessa ha la stessa frequenza di quella incidente,v’ v<solo in casi di conservazione dell'energia, di norma abbiamo sempre .

La fluorescenza avviene con velocità di decadimento tipiche: questa velocità del processo è descrivibilev d[M*]/dt k= = [M*]come: , dove k è la costante di decadimento, esistono valori benr− ⋅rdefiniti di k , se e solo se k assume valori tipici di fenomeni di fluorescenza, allora parliamo dir rfluorescenza. k si esprime in s , numero di eventi su unità di tempo.-1rGli elettroni che subiscono l’eccitazione possono avere spin opposto, nel singoletto (accoppiamentodi due elettroni):l’elettrone passa al livello successivo,

mantenendo il suo spin; ma talvolta l'eccitazione può causare variazione dello spin, il decadimento del singoletto è associato alla fluorescenza.

Diagramma di Jablonski

Il diagramma che illustra le tipologie di decadimento. Quando le emissioni avvengono tra stadi diversi di uno stesso livello energetico, non li rileviamo con la fluorescenza; la fluorescenza avviene per salti da livelli s a s', ma solo per elettroni che si trovino in singoletto.

In questa tabella vediamo elementi di rilassamento (i pallini neri), che non vediamo come radiazioni luminose; la fluorescenza prevede tempi di decadimento nell'ordine di nanosecondi ai microsecondi. La fosforescenza invece prevede tempi più lunghi.

La quantità di energia associata alla fluorescenza: la quantità di energia associata al decadimento è inferiore rispetto all'onda incidente, ne deriva un lunghezza d'onda più grande; maggiori lunghezze d'onda vuol dire uno

spostamento dello spettro verso il rosso: questo spostamento è definito red shift, spostamento verso destra, verso il rosso, oppure scattering Stokes'. Lo shift è quindi derivante dalla non conservazione dell'energia. Qui vediamo un tipico spettro di fluorescenza: vediamo uno spettro di assorbimento e di emissione di una certa molecola. Vediamo un picco di massimo assorbimento a 495nm, e un picco di emissione a 520nm; vediamo evidenziato il red shift, di 25nm. La slide mostra il comportamento di alcuni fluorofori: definiamo fluorofori determinate molecole che rispondano al fenomeno di irraggiamento attraverso fenomeni di fluorescenza. Sopra vediamo i due spettri; non possiamo prevedere lo shift dallo spettro di assorbimento, bensì dalle caratteristiche tipiche della molecola, possiamo solo sapere che la lunghezza d'onda sarà maggiore e la frequenza minore. L'intensità della fluorescenza è associata al valore della di eccitazione.spettro di emissione è invariato, le caratteristiche sono λ λ eccsimili, ma gli spettri differiscono quantitativamente, l'energia che eccita il fluoroforo è maggiore per frequenze maggiori. L'emissione avverrà sempre in corrispondenza della stessa di λ emissione (come vediamo dal grafico a destra, l'emissione è sulla stessa x, ma varia y, l'intensità). Lo shift non è facilmente prevedibile, ma si misura direttamente; dallo spostamento, da quanto è distante il picco di emissione a quello di assorbimento capiamo quanto è ottimo il processo: più i picchi sono distanti e distinti, migliore è il processo, possiamo fare migliori letture del segnale. La fluorescenza può essere misurata ad una data e fissa di emissione, λ mentre la della radiazione incidente cambia (spettro di eccitazione); oppure mantenendo λ costante la e misurando la fluorescenza in un range di vari.(spettro di emissione).λ λeccIl quenching, lo smorzamentoLa quantità di energia associata alla radiazione emessa è descrivibile tramite la resa quantica:fotoni emessi assorbiti= /fotoni . Rese quantiche pari a 1 sono solo teoriche, perché φfparte dell'energia viene inevitabilmente dispersa come calore. I fenomeni di decadimento dellemolecole, senza emissione, che non possiamo cogliere come fluorescenza, descriviamoquesto fenomeno come quenching: fenomeno che causa dispersione di energia, sottraendoalla radiazione emessa, che noi non cogliamo.Riconosciamo un quenching statico: il segnale di fluorescenza che osserviamo aumenta permaggiori concentrazioni di molecole; ma oltre un certo valore, questo peggiora: le molecole insoluzione sono così vicine da trasferire l'energia che ha eccitato gli elettroni. Prima che laradiazione venga emessa, essa si disperde nel passaggio tra le varie molecole, quenching