appunti istopatologia

Laboratorio di preparazioni istopatologiche

Processazione preanalitica dei campioni

• Fissazione
• Decalcificazione
• Disidratazione
• Chiarificazione
• Inclusione
• Taglio
• Colorazione
• Montaggio

Fissazione e Decalcificazione sono due processi utilizzati per la preparazione dei tessuti. Inclusione e taglio sono invece due processi necessari alla corretta preparazione delle sezioni microtomiche (il microtomo è uno strumento che taglia sezioni, 4 micrometri, usate per studiare i campioni).

Fissazione

La fissazione permette di inibire i processi di autolisi del campione, ne mantiene integra la struttura antigenica e tissutale e permette di conservare gli acidi nucleici. Il fissativo ideale è in grado, appunto, di conservare morfologia, acidi nucleici e determinanti antigenici di una cellula; tuttavia non esiste un fissativo in grado di soddisfare tutti e tre questi requisiti.

Una fissazione errata può essere esagerata o insufficiente. Se prendiamo un campione troppo spesso, esso fissa troppo nella parte esterna, e poco nella parte centrale, in questo caso (fissazione insufficiente), bisogna tagliare il campione in parti più piccole. Con sezioni troppo sottili si ottiene una fissazione esagerata, le proteine possono essere troppo coperte da ponti metilenici e dare poi risultati errati durante le analisi. La fissazione, inoltre, va fatta a temperatura ambiente, perché il freddo rallenta il processo, mentre il calore lo velocizza troppo.

Fissativi chimici

• Fissativi coagulanti: fissano disidratando e coagulando le proteine, le proteine così denaturate perdono la loro specificità (es: alcol, acetone).
• Fissativi additivi: fissano aggiungendo gruppi metilici organici (es: aldeidi, alcoli).
• Miscele fissative: miscele con complessi metallici o a base di acidi, le miscele più usate sono Bouin, B5, Zenker, Serra.

Fissativi fisici

• Calore
• Essicazione
• Congelamento: avviene in camere di congelamento a -15/-30°C per i tessuti molli, o tramite congelamento rapido durante gli esami intraoperatori. Per il congelamento vengono anche usati l'Azoto liquido e la resina OCT.

Metodi di fissazione

• Immersione: il campione viene immerso in un quantitativo di fissativo molto superiore al volume del campione stesso (10/20 volte maggiore).
• Perfusione: il fissativo viene infuso su cavie da laboratorio.
• Vapori: pericolosi e quindi poco usati.

Principali fissativi

• Formalina/formaldeide/aldeide formica: è il fissativo più usato, una soluzione di 10% aldeide formica e 90% acqua, usata al 4% in una soluzione tampone, mantiene la morfologia del tessuto ma degrada gli acidi nucleici e la struttura antigenica. La formalina è incolore ed ha un odore pungente; è un fissativo additivo non coagulante, che forma legami o ponti aldeidici tra le catene delle proteine grazie ai gruppi metilici. Si verifica quindi una gelificazione delle proteine. Contatto, inalazione o ingestione di formalina hanno probabile effetto cancerogeno.
• Chetoni: i fissativi chetonici, come l'acetone, vengono utilizzati nei preparati citologici e nelle tecniche di immuno fluorescenza IF.
• Glutaraldeide: è una soluzione acquosa al 25-50%, usata anch'essa al 4% in soluzione tampone. Il suo funzionamento è identico a quello della formalina, ma è più costosa ed è usata principalmente in microscopia elettronica.
• Acido acetico: utilizzato in miscele come Bouin, Zenker e Serra.
• Alcol: i fissativi alcolici hanno un effetto disidratante che fa precipitare le proteine e sono usati principalmente nella fissazione delle urine, l'alcool etilico in particolare è usato nelle miscele Bouin e Serra.
• Acido picrico: è un coagulante delle proteine che degrada gli acidi nucleici, viene utilizzato in soluzione alcolica o in miscele fissative.

Miscele fissative

• Fissativo di Dubosq: denatura gli acidi nucleici.
• Fissativo di Bouin: miscela formata da acido picrico, acido acetico e formaldeide. Viene usata per le colorazioni tricromiche AFOG ma è sconsigliata per SNC e ricerche IIC.
• Fissativo di Serra: miscela formata da alcol etilico, formaldeide e acido acetico che viene utilizzata nelle biopsie renali.
• Fissativo B5: formato da formaldeide e cloruro di mercurio, poco utilizzato ma preserva la morfologia del nucleo.
• Fissativo di Zenker: miscela formata da acqua, cloruro di mercurio, bicromato di potassio e solfato di sodio. Viene utilizzata nella colorazione dei muscoli.

Decalcificazione

Rimozione della parte minerale dell'osso, viene solitamente effettuata usando l'EDTA, una sostanza chelante che si satura di ioni CA⁺⁺ sottraendoli alla matrice ossea.

• EDTA: soluzione al 5,5% con tampone fosfato a pH 7,4.

Disidratazione

Il campione è immerso in un agente chimico anidro, che si sostituisce all'acqua nel campione, solitamente per questo processo si usa l'alcool etilico.

Chiarificazione

Si utilizza un agente chiarificante, solitamente lo xilolo, per sostituire l'alcool presente nel campione dopo la disidratazione; questo processo permette di rendere il campione traslucido e impregnabile di paraffina liquida.

Impregnazione/Inclusione

Il campione viene immerso in una matrice che ne permetterà poi il taglio. Come matrice solitamente si usa la paraffina liquida, che si presenta come una cera solida a temperatura ambiente, ma che fonde a circa 56°C e che è solubile in sostanze chiarificanti come lo xilolo. In rari casi invece della paraffina si utilizza la celloidina.

Taglio

Utilizzando il microtomo, si tagliano sezioni del campione di circa 4-6 micrometri, sezione, cioè, spesse quanto una cellula.

Colorazioni

I coloranti si classificano in:

• Coloranti artificiali o di anilina: cloruro di acetato
• Coloranti acidi: sali di sodio
• Coloranti basici
• Coloranti naturali animali
• Coloranti naturali vegetali: ematossilina, orceina

Acidofilia: affinità di un substrato istologico ad un colorante acido

Basofilia: affinità di un substrato istologico ad un colorante basico

Per evidenziare le strutture cellulari viene utilizzata la colorazione Ematossilina-Eosina, colorazione utilizzata solamente nelle procedure istologiche.

Le colorazioni possono avvenire mediante meccanismi:

• Fisici: la colorazione avviene attraverso meccanismi fisici come impregnazione, solubilità o diffusione.
• Chimici: la colorazione avviene grazie a legami chimici specifici.
• Fisico-chimici: assorbimento elettrico, assorbimento superficiale.

Tipologie di colorazione

• Colorazioni raggressive: si sovracolora il campione e successivamente si elimina il colorante in eccesso.
• Colorazione progressiva: si lascia agire il colorante fino al raggiungimento del giusto grado di colorazione.
• Colorazione simultanea: si utilizzano miscele di più coloranti.