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appunti istopatologia

Appunti di citologia e istologia: laboratorio riassuntivi delle principali tecniche e procedure che si svolgono in un laboratorio di istopatologia basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Boldorini dell’università degli Studi Cattolica del Sacro Cuore - Roma Unicatt. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Citologia e istologia: laboratorio docente Prof. R. Boldorini

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Colorazioni ragressive: si sovracolora il campione e successivamente si elimina il , colorante in

eccesso.

Colorazione progressiva: si lascia agire il colorante fino al raggiungimento del giusto grado di

colorazione

Colorazione simultanea: si utilizzano miscele di più coloranti insieme

colorazione successiva: si utilizzano singoli coloranti in sequenza

colorazione diretta/sostantiva: colorazione eseguita senza mordenzante

colorazione indiretta/aggiuntiva: colorazione effutata mediante un mordenzante

colorazione istochimica: evidenzia il tipo di sostanza presente in un tessuto e sua topografia

colorazione istomorfologica: mette in evidenza le strutture all'interno della cellula

colorazioni topografiche: colorazioni combinate di più colori, la più usata è

l'ematossilina-eosina (EE), in cui l'ematossilina colora in blu-violetto i componenti basofili e

l'eosina colora in rosso-rosa i componenti acidofili

mordenzante:sostanza chimica che facilita l'ancoraggio tra colorante e tessuto, solitamente

come mordenzanti si usano ossidanti quali acido bromico, iodio e acido fosfomolibdico

Lacche: miscele di mordenzante e colorante.

Lacche alluminiche: contengono come mordenzante l'alluminio di potassio funzionano a pH

acido e colorano bene il nucleo. Nelle lacche alluminiche rientrano l'emallume di Carazzi e

l'ematossilina di Harris:

Lacche ferriche: usano il ferro come mordenzante

Lacche cromiche: usano l'allume cromico come mordenzante

ANATOMIA PATOLOGICA

Eziologia:studio delle cause che determinano lo sviluppo di una determinata patologia

Patogenesi: studio dei meccanisimi moolecolari che portano alla comparsa e allo sviluppo di

una patologia.

Prognosi: valutazione del danno prodotto e valutazione della possibile evoluzione futura della

patologia indipendentemente dalla terapia applicata.

ANATOMIA PATOLOGICA MACROSCOPICA

Il patologo fa una prima analisi del campione osservandolo ad occhio nudo o con l'uso di lenti

valutando volume, colore e forma del campione. La diagnostica macroscopica è utilizzata

soprattutto nelle autopsie.

ANATOMIA MICROSCOPICA

La diagnostica microscopica viene effettuata con lenti o microscopi e utilizzando diversi tipi di

colorazioni.

Tecniche di biologia molecolare estrattiva: analisi del materiale estratto dalle cellule (ES DNA;

RNA). Comporta la distruzione del tessuto.

Tecniche di morfologia molecolare: analisi in sito delle molecole per non compromettere

l'integrità del tessuto.

Tra le patoligie più studiate ci sono:

Sarcoma di Ewing: un tumore infantile causato da una traslocazione reciproca di due geni con

risultante gene di fusione il gene EWS-FLI1. Per studiarla si usa la tecnica FISH per marcare i

cromosomi 11 e 22 per vedere se è avvenuta una fusione, ovvero se una dei due cromosomi è

traslocato sull'altro.

Neuroblastoma: tumore pediatrico che colpisce la midollare del surrene, che si presenta come

un ingrossamento del surrene causato dai neuroblasti, cioè dalla stuttura nervosa di cui è

composta la giandola surrenale, che proliferano eccessivamente. Nel 25% dei casi si ha inoltre

un'ampificazione genica dell'oncogene N-myc, che può aggravare la patologia causando la

perdita di geni oncosoppressoril.

Esistono due tipi di diagnosi microscopiche diverse:

Diagnosi istologica: esame di tessuti solitamente fissati in formalina, si effettua tramite biopsia,

ovvero il prelievo di un frammento di tessuto vivo, o tramite agobiopsie (biopsie eseguite

mediante aghi). Esiste la diagnosi istologica convenzionale, che richiede parecchio tempo, e

quella intraoperatoria.

Diagnosi citologica: esame delle singole cellule, molto complessa poichè richiede l'estrazione

delle cellule dal tessuto. Esiste l'estrazione diretta ( o spontanea) e indiretta ( indotta). Questa

diagnosi necessita di condizioni perfette di colorazione e fissazione.

DIAGNOSTICA INTRAOPERATORIA

La diagnosi intraoperatoria è un esame istologico effettuato nel corso di un intervento

chirurgico. Durante l'operzione, il chirurgo preleva un campione fresco che viene inviato al

laboratorio di anatomia patologia, qui, non avendo il tempo di fissare poichè il paziente è sotto

anestesia, la fissazione avviene tramite congelamento rapido in criostato a -25°C, dopodichè di

esegue una colorazione rapida con blu di tiolina o EE. La sezione viene poi montata e letta da

patologo che poi da un responso al chirurgo. Tutta l'operazione dura circa 30 minuti e dopo

l'invio dei risultati al chirurgo il campione verrà poi scongelato e fissato in formalina. Verrà poi

rianalizzato per effettuare la prove del 9 della analisi intraoperatoria.

CITOLOGIA

La citologia studia le caratteristiche morfologiche delle cellule libere (non associate ad un

tessuto), studia inoltre le modificazioni cellulari prodotte da processi neoplastici, infiammatori e

virali.

Citologia esfoliativa diretta/spontanea: raccolta di cellule che esfoliano spontaneamente, questa

citologia puo essere effettuata su un espettorato o un versamento. I liquidi da versamento sono

analizzati a fresco dopo l'aggiunta di anticoagulante, bisogna ricordare inoltre che le cellule

esfliano secondo il loro ciclio naturale e che in caso di tumore le cellule esfoliano in modo più

massiccio. Si utilizzano, inoltre, 3 campioni raccolti in 3 giorni consecutivi.

Citologia esfoliativa indiretta/indotta:l'esfoliazione viene indotta artificialmente tramite metodiche

invasive, le cellule così staccate vengono raccolte ed analizzate. Questa pratica è usata, ad

esmpio, nel PAP TEST

Citologia ago aspirativa: il tessuto viene prelevato tramite aghi. Questa procedura può essere

fatta a mano libera o essere guidata da una strumentazione radiologica come ECO o TAC.

Le cellule prelevate vengono analizzate tramite:

Striscio:metodo utilizzato per creare un monostrato di cellule immediatamente fissato o

essiccato all'aria, usato per versamenti e PAP TEST.

Strato sottile: usato per creare un monostrato di cellule facile da leggere, usato in citologia

cervico-vaginale

Citoincluso: materiale fissato in formalina che viene poi incluso in paraffina

Citospin: utilizzato per le urine, il vetrino viene centrifugato in modo che le cellule si attacchino

alla parete del vetrino. I pozzetti così ricavati vanno poi fissati e colorati in Papanicolau

colorante composto da ematossilina e Orange G)..

I principali coloranti in citologia sono il Papanicolau, l'EE e il colorante di

May-Grunwald-Giemsa. Come fissativi, invece, in citologia vengono principalmente usati i

fissativi a base di alcol.

IMMUNOISTOCHIMICA (IIC)

L'immunoistochimica o IIC è l'insieme delle tecniche che utilizzano anticorpi specifici (Ab) per

identificare antigeni specifici (Ag). Gli antigeni sono molecole proteiche, lipoproteiche o

glicoproteiche in grado di provocare una risposta del sistema immunitario. Ogni antigene ha un

epitopo o determinante antigenico, ovvero un sito che reagisce con l'anticorpo.

Caratteristiche di un anticorpo:

Specificità: ogni anticorpo è specifico per ogni antigene

Affinità: è la forza del legame antigene-anticorpo

Reattività: capacità dell'anticorpo di legarsi in modo specifico ad un antigene.

Avidità: velocita con cui l'anticorpo si lega all'antigene

Sensibilità: capacità dell'anticorpo di legarsi a quantita minime di antigene.

La reazione immunoistochimica ideale è sia sensibile che specifica, poi deve essere in grado di

riconoscere solo un antigene e deve riconoscerlo anche in minime quantità, tuttavia di solito più

un anticorpo è sensibile e meno è specifico. In particolare bisogna ricordare che gli anticorpi

monoclonali sono molto specifici ma poco sensibili, mentre gli anticorpi policlonali sono molto

sensibili ma poco specifici.

A causa di ciò, si possono ottenere due tipi di risultati errati:

Falso positivo: un campione che risulta positivo al test che abbiamo fatto ma che in realtà non

lo è e può essere causato dal citoplasma che diffonde all'esterno o da tessuto necrotico che

rpovocano legami aspecifici con l'anticorpo.

Falso negativo: un campione che risulta negativo al test che abbiamo fatto anche se in realtà

non lo è e può essere causato essiccamento, elettro o crio-resezione che causano la perdita

dell'antigene.

Molto importante nelle procedure immunoistochimiche, è l'utilizzo di un fissativo adatto,per

esempio per preparare strici e citocentrifugati, prima vengono disidratati all'aria aperta e poi

fissati con acetone freddo o etanolo per 10 minuti. In generale per ogni procedura

immunoistochimica, si predilige l'utilizzo di fissaticvi coagulantincome alcol etilico, motanoloo o

acetone, che provocano la liberazione delle catene laterali e la linearizzazione delle catene

polipeptidiche. I fissativi additivi come la formalina, mascherano le strutture antigeniche,

impedendo il legame con l'anticorpo. L'antigenicità, tuttavia, può essere ripristinata.

Per ripristinare l'antigenicità si usano due metodi, la digestione enzimatica, in cui si utilizzano

proteinasi che rompono i ponti metilici tra antigene ed anticorpo (Gli enzimi più usati sono la

tripsina, la pepsina e la proteinasi K), oppure si utilizzano sostanze chelanti ad alta temperatura,

in particolare un agente molto usato è l'EDTA.

TECNICHE IMMUNOISTOCHIMICHE

In IIC si utilizzano le immunoglobuline G (IgG), che possono essere anticorpi monoclonali,

policlonali o ibridi. Gli anticorpi monoclonali sono uguali tra loro e specifici per un singolo

epitopo di un determinato antigene; vengono prodotte da cellule dette ibridomi, ovvero il

risultato della fusione tra un linfocita B (in grado di produrre anticorpi) e una cellula mielomatosa

( in grado dei riprodursi e sopravvivere a lungo). Gli anticorpi policlonali sono invece anticorpi

prodotti da cellule diverse che sono in grado di riconoscere divewrsi epitopi di un singolo

antigene.

Le tecniche di IIC si avvalgono sia di anticorpi che di molecole traccianti in grado di evidenziare

le reazioni tra anticorpo ed antigene. Le molecole traccianti più usate sono:

-Fluorocromi:indicatori cromatici come la rodamina o l'istocianato di fluorescina, hanno lo

svantaggio di avere un periodo di estinzione molto breve, infatti perdono la loro fluorescenza se

non conservati a basse temperature.

- Metalli colloidali: coniugati di oro o argento, sono usati nella microscopia elettronica e nella

tecnica dell'immunogold

-Enzimi: gli enzimi usati in IIC devono avere basso peso molecolare, non devono denaturare le

immunoglobuline, devono essere assenti nel tessuto del campione e devono formare legami


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DETTAGLI
Corso di laurea: Biotecnologie mediche
SSD:

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher cantagallo17 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Citologia e istologia: laboratorio e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Cattolica del Sacro Cuore - Roma Unicatt o del prof Boldorini Renzo.

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