appunti istopatologia

DIAGNOSTICA INTRAOPERATORIA

La diagnosi intraoperatoria è un esame istologico effettuato nel corso di un intervento

chirurgico. Durante l'operzione, il chirurgo preleva un campione fresco che viene inviato al

laboratorio di anatomia patologia, qui, non avendo il tempo di fissare poichè il paziente è sotto

anestesia, la fissazione avviene tramite congelamento rapido in criostato a -25°C, dopodichè di

esegue una colorazione rapida con blu di tiolina o EE. La sezione viene poi montata e letta da

patologo che poi da un responso al chirurgo. Tutta l'operazione dura circa 30 minuti e dopo

l'invio dei risultati al chirurgo il campione verrà poi scongelato e fissato in formalina. Verrà poi

rianalizzato per effettuare la prove del 9 della analisi intraoperatoria.

CITOLOGIA

La citologia studia le caratteristiche morfologiche delle cellule libere (non associate ad un

tessuto), studia inoltre le modificazioni cellulari prodotte da processi neoplastici, infiammatori e

virali.

Citologia esfoliativa diretta/spontanea: raccolta di cellule che esfoliano spontaneamente, questa

citologia puo essere effettuata su un espettorato o un versamento. I liquidi da versamento sono

analizzati a fresco dopo l'aggiunta di anticoagulante, bisogna ricordare inoltre che le cellule

esfliano secondo il loro ciclio naturale e che in caso di tumore le cellule esfoliano in modo più

massiccio. Si utilizzano, inoltre, 3 campioni raccolti in 3 giorni consecutivi.

Citologia esfoliativa indiretta/indotta:l'esfoliazione viene indotta artificialmente tramite metodiche

invasive, le cellule così staccate vengono raccolte ed analizzate. Questa pratica è usata, ad

esmpio, nel PAP TEST

Citologia ago aspirativa: il tessuto viene prelevato tramite aghi. Questa procedura può essere

fatta a mano libera o essere guidata da una strumentazione radiologica come ECO o TAC.

Le cellule prelevate vengono analizzate tramite:

Striscio:metodo utilizzato per creare un monostrato di cellule immediatamente fissato o

essiccato all'aria, usato per versamenti e PAP TEST.

Strato sottile: usato per creare un monostrato di cellule facile da leggere, usato in citologia

cervico-vaginale

Citoincluso: materiale fissato in formalina che viene poi incluso in paraffina

Citospin: utilizzato per le urine, il vetrino viene centrifugato in modo che le cellule si attacchino

alla parete del vetrino. I pozzetti così ricavati vanno poi fissati e colorati in Papanicolau

colorante composto da ematossilina e Orange G)..

I principali coloranti in citologia sono il Papanicolau, l'EE e il colorante di

May-Grunwald-Giemsa. Come fissativi, invece, in citologia vengono principalmente usati i

fissativi a base di alcol.

IMMUNOISTOCHIMICA (IIC)

L'immunoistochimica o IIC è l'insieme delle tecniche che utilizzano anticorpi specifici (Ab) per

identificare antigeni specifici (Ag). Gli antigeni sono molecole proteiche, lipoproteiche o

glicoproteiche in grado di provocare una risposta del sistema immunitario. Ogni antigene ha un

epitopo o determinante antigenico, ovvero un sito che reagisce con l'anticorpo.

Caratteristiche di un anticorpo:

Specificità: ogni anticorpo è specifico per ogni antigene

Affinità: è la forza del legame antigene-anticorpo

Reattività: capacità dell'anticorpo di legarsi in modo specifico ad un antigene.

Avidità: velocita con cui l'anticorpo si lega all'antigene

Sensibilità: capacità dell'anticorpo di legarsi a quantita minime di antigene.

La reazione immunoistochimica ideale è sia sensibile che specifica, poi deve essere in grado di

riconoscere solo un antigene e deve riconoscerlo anche in minime quantità, tuttavia di solito più

un anticorpo è sensibile e meno è specifico. In particolare bisogna ricordare che gli anticorpi

monoclonali sono molto specifici ma poco sensibili, mentre gli anticorpi policlonali sono molto

sensibili ma poco specifici.

A causa di ciò, si possono ottenere due tipi di risultati errati:

Falso positivo: un campione che risulta positivo al test che abbiamo fatto ma che in realtà non

lo è e può essere causato dal citoplasma che diffonde all'esterno o da tessuto necrotico che

rpovocano legami aspecifici con l'anticorpo.

Falso negativo: un campione che risulta negativo al test che abbiamo fatto anche se in realtà

non lo è e può essere causato essiccamento, elettro o crio-resezione che causano la perdita

dell'antigene.

Molto importante nelle procedure immunoistochimiche, è l'utilizzo di un fissativo adatto,per

esempio per preparare strici e citocentrifugati, prima vengono disidratati all'aria aperta e poi

fissati con acetone freddo o etanolo per 10 minuti. In generale per ogni procedura

immunoistochimica, si predilige l'utilizzo di fissaticvi coagulantincome alcol etilico, motanoloo o

acetone, che provocano la liberazione delle catene laterali e la linearizzazione delle catene

polipeptidiche. I fissativi additivi come la formalina, mascherano le strutture antigeniche,

impedendo il legame con l'anticorpo. L'antigenicità, tuttavia, può essere ripristinata.

Per ripristinare l'antigenicità si usano due metodi, la digestione enzimatica, in cui si utilizzano

proteinasi che rompono i ponti metilici tra antigene ed anticorpo (Gli enzimi più usati sono la

tripsina, la pepsina e la proteinasi K), oppure si utilizzano sostanze chelanti ad alta temperatura,

in particolare un agente molto usato è l'EDTA.

TECNICHE IMMUNOISTOCHIMICHE

In IIC si utilizzano le immunoglobuline G (IgG), che possono essere anticorpi monoclonali,

policlonali o ibridi. Gli anticorpi monoclonali sono uguali tra loro e specifici per un singolo

epitopo di un determinato antigene; vengono prodotte da cellule dette ibridomi, ovvero il

risultato della fusione tra un linfocita B (in grado di produrre anticorpi) e una cellula mielomatosa

( in grado dei riprodursi e sopravvivere a lungo). Gli anticorpi policlonali sono invece anticorpi

prodotti da cellule diverse che sono in grado di riconoscere divewrsi epitopi di un singolo

antigene.

Le tecniche di IIC si avvalgono sia di anticorpi che di molecole traccianti in grado di evidenziare

le reazioni tra anticorpo ed antigene. Le molecole traccianti più usate sono:

-Fluorocromi:indicatori cromatici come la rodamina o l'istocianato di fluorescina, hanno lo

svantaggio di avere un periodo di estinzione molto breve, infatti perdono la loro fluorescenza se

non conservati a basse temperature.

- Metalli colloidali: coniugati di oro o argento, sono usati nella microscopia elettronica e nella

tecnica dell'immunogold

-Enzimi: gli enzimi usati in IIC devono avere basso peso molecolare, non devono denaturare le

immunoglobuline, devono essere assenti nel tessuto del campione e devono formare legami

stabili con l'anticorpo.

La reazione antigene-anticorpo può avvenire in due modi:

Metodo diretto: in questo caso l'anticorpo si lega all'antigene con rapporto 1:1. In questo caso

l'anticorpo è marcato con un fluorocromo che evidenzia la reazione.

Metodo indiretto: uso successivo di due anticorpi, un anticorpo primario che si lega all'antigene

ed un anticorpo sedcondario coniugato con un enzima e diretto contro l'anticorpo primario.

Le procedure più usate in IIC sono

-Metodo PAP: L'anticorpo secondario funziona da ponte tra l'anticorpo primario ed il sistema

PAP

- Metodo avidina-biotina: in questa tecnica si usa un anticorpo primario biotinilato, la

streptoavidina si lega alla biotina sull'Ab1 facendo da ponte per la perossidasi che evidenzia la

reazione.

-Metodo Envision: l'anticorpo primario è legato ad una struttura polimerica detta Envision, che

amplifica il segnale della perossidasi.

CONTROLLI DELLE REAZIONI IIC

Per valutare la correttezza di un test si effettuano due tipi di controlli, un controllo positivo ed un

controllo negativo. Il controllo positivo evidenzia i falsi negativi ed è quindi un controllo di

sensibilità; il controllo negativo evidenzia i falsi positivi ed è quindi un controllo di specificità.

Le variabili che influenzano la presenza o meno di asrtefatti (risultati errati) sono:

- Adeguatezza del campione

-Caratteristiche dell'anticorpo

-Conservaziopne dell'antigenicità

-idoneità della reazione antigene-anticorpo

-attendibilità e corretta interpretazione dei dati

Nello swpecifico, le cause di un falso positivo possono essere:

- Reattività non specifica: reazione tra una molecola diversa dall'antigene ricercato e uno dei

componenti del sistema rivelatore

-Mancanza di specificità dell'anticorpo: l'anticorpo primario può non essere completamente

specifico per l'antigene target, questo avviene soprattutto quando si usano anticorpi policlonali.

-Diffusione e captazione dell'antigene: causata da una fissazione ritardata.

La causa dei falsi negativi invece, risiede spesso nella bassa capacità dell'anticorpo di legare

l'antigene.

ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI E SEQUENZIAMENTO DIRETTO DA

MATERIALE ISTO-CITOLOGICO

Per estrarre gli acidi nucleici da campioni isto-citologici, i campioni vanno prima fissati e

paraffinati. Si possono anche estrarre gli acidi nucleici da strisci e liquidi biologici. Se

però si utilizza, per la fissazione, formalina acida o un fissativo diverso dalla formalina,

come il Glyo fixx, si ottiene la degradazione degli acidi nucleici. Anche tempi di

fissazione troppo lunghi posso portare alla degradazione degli acidi nucleici.

Le tecniche di estrazione utilizzate variano a seconda del campione:

Fenolo-cloroformio: questa tecnica si usa su campioni di tessuto paraffinato. Dopo aver

eliminato lo xilolo dal campione tramite un lavaggio in etanolo, si procede ad un bagno

in fenolo, che denatura le proteine, e cloroformio, che solubilizza i lipidi. Infine si

procede ad un bagno in etanolo che fa precipitare il DNA.

Colonne di silice:questa tecnica si usa per il materiale citologico e si basa sull'affinità

degli acidi nucleici alla silice. Le molecole di DNA sono di ottima qualità, tuttavia se ne

ottiene una quantitò modesta.

Biglie magnetiche: questa tecnica si utilizza per gli strisci e si basa sull'affinità del DNA

alle microsfere di silice magnatica.

Sistema automatizzato di estrazione del DNA: questa tecnica si usa per i campioni

liquidi. Si utilizza uno spettrofotometro che legge il campione secondo la legge di

Lambert-Beer ( gli acidi nucleici vengono letti a 260nm).

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

La PCR è una tecnica per l'amplificazione in vitro di un frammento di DNA. Questa

tecnica necessita di magnasio, acqua, soluzione tampone, DNA polimerasi batterica e

infine dei nucleotidi, il tutto va aggiunto in una provetta