Introduzione tecniche laboratorio - Appunti

Metodi biofisici per lo studio delle proteine

Spettrometria di massa: gli spettrometri di massa sono composti da tre parti principali: la sorgente, l'analizzatore e il detector. La sorgente è di ioni, in quanto crea ioni da trasferire in fase gassosa. Le molecole di interesse sono caricate e portate in stato gassoso. Così, con cambiamenti magnetici, elettrici o di pressione, posso guidare le molecole nello spettrometro. Entrano nella macchina per arrivare all'analizzatore. Subito dopo la sorgente, troviamo un alto grado di vuoto (grazie a delle pompe) che permette agli ioni di non collidere con molecole di aria. Poi si va all'analizzatore che permette di suddividere gli ioni generati in sorgente a seconda del rapporto massa/carica. Lo spettrometro misura il rapporto massa/carica. Separati gli ioni, si raggiunge il detector che è la parte che rileva e conta gli ioni. Le sorgenti di ioni sono di due tipi principali. Le prime erano molto invasive perché

andavano a frammentarele molecole stesse. Tanaka inventò la MALDI. Il campione e i suoi analiti sono intrappolati in unamatrice solida. Un raggio laser agisce sulla matrice inmodo tale da generare pezzi di matrice e quindi dicampione. Il laser fa desolvatare la matrice e gli ioni. Così le molecole si ionizzano e entrano in fase gassosa. Mentre Fenn inventò l'elettrospray. Si parte da un campione liquido che entra in un capillare rivestito di materiale metallico. Alla punta del capillare viene applicata una differenza di potenziale elettrico all'ingresso dello spettrometro. Il campo elettrico fanebulizzare la soluzione creando delle goccioline che progressivamente vanno a desolvatarsi e esplodere per vari cicli fino ad ottenere l'analita da solo carico elettricamente. Sono due metodi che permettono di nonrompere le molecole, preservare legami covalenti e averle cariche in fase gassosa. Uno spettro di massa è un grafico in cui sulle ascisse abbiamo il

valore massa/carica degli ioni e sulle ordinatel'intensità. MALDI genera quasi esclusivamente ioni monocarica, si ottiene un unico picco. Nell'esempio essendo la carica +1, m/z è quasi la massa dello ione. Nel grafico di elettrospray generalmente si generano ioni multicarica. Si ha anche eterogeneità di carica, la molecola avrà diverse cariche. Quindi nel grafico ho più picchi perché la molecola ha la stessa massa ma avrà z cioè cariche diverse. Il vantaggio del MALDI è quello di avere un picco per una molecola di solito a +1, quindi il grafico risulta più semplice da leggere. Nell'elettrospray è più complicato leggere il grafico, ma quante cariche prende la proteina dipende dalla conformazione di essa. Posso capire la massa e la carica delle molecole con la distribuzione isotopica delle molecole. Posso fare l'ingrandimento dei picchi. Vedo che ogni picco è composto da una serie di

picchi vicini tra loro perché ogni molecola ha una distribuzione isotopica degli atomi. In quanto gli atomi si presentano in più isotopi. Ogni molecola non ha un'unica massa ma dipende dagli isotopi che la compongono. La massa mono-isotopica della molecola è la massa della versione della molecola in cui tutti i suoi atomi sono i più leggeri. Le varie versioni della molecola hanno una differenza di massa di un Dalton a seconda di ogni neutrone incorporato al suo interno. Ogni molecola, al di là di quante cariche ha preso nella spettrometria di massa, genera tanti picchi per la contribuzione degli isotopi che rendono eterogenea la sua massa. Quindi, negli ingrandimenti, vedo la versione mono-isotopica della molecola, la più leggera, che ha il picco più alto e poi le altre versioni della molecola. In teoria, tra i picchi devo avere la differenza di 1 Dalton perché è il peso del neutrone, ma non è così. Ciò perché

resonance (ICR) e Orbitrap. L'accuratezza è data dall'errore della massa misurata dallo spettrometro e la massa vera. Accuratezza = errore/massa = (massa misurata-massa reale)/massa reale. Ad esempio l'errore di un Dalton su una proteina da 100kDa porta a una accuratezza di 10 ppm (parti per milione).

Come analizzatore possiamo avere quattro barre in cui in diagonale hanno la stessa carica. Quindi gli ioni formati alla sorgente si muoveranno sfruttando quelle di carica opposta. La polarità delle barre varia in modo ciclico. Così gli ioni si muovono con una traiettoria elicoidale. Quindi posso far passare alcuni ioni con un rapporto m/z entro un certo range e altri ioni sono da fare uscire essendo fuori dal range. Quindi fa da filtro. Gli ioni di interesse entrando in un tubo, il tempo di volo. Gli ioni hanno un impulso elettrico che li porta al detector. Il tempo impiegato dall'impulso al detector dipende da m/z. Se il rapporto è grande, gli

Le particelle più grandi ci metteranno più tempo a muoversi rispetto a quelle più piccole. Traduce il tempo in un segnale che permette di ritrovare lo spettro di massa. Una applicazione è quella della proteomica che analizza tutte le proteine presenti in un sistema. Si usa l'analisi bottom-up. Faccio a pezzi le proteine in analisi e guardo i peptidi con la spettrometria di massa e poi cerco di ricostituire l'identità e la quantità delle proteine. Esiste anche il metodo top-down. Bottom-up: Per confrontare due campioni posso fare la mappa 2D, facendo la separazione delle proteine con SDS-PAGE e punto isoelettrico. Vedo i due gel e vedo gli spot identici e quelli diversi. Per identificare queste proteine recupero dal gel la banda di interesse. La taglio col bisturi e la metto in una provetta. Riduco e alchilo possibili ponti di solfuro. Digerisco la proteina con una proteasi e poi purifico i peptidi ottenuti. Tutti i peptidi sono analizzati in spettrometria di massa per poi

arrivare all'identificazione della proteina. Nella shot-gun proteomics digerisco tutte le proteine del campione e analizzo tutti i peptidi e solo a posteriori ricavo le identità delle proteine. Per digerire si usa spesso tripsina che è molto specifica, infatti i peptidi che si generano avranno al C-terminale una lisina o arginina. Di solito genero peptidi con più carica perché arginina e lisina sono carichi come gli amminoacidi del N-terminale. Quindi posso inserire tutti i peptidi della proteina nello spettrometro ottenendo tanti picchi oppure posso dividere i peptidi tramite cromatografia e poi per ognuno fare spettrometria. Poi vedo le distribuzioni isotopiche di ogni picco. Avendo la carica ricavo la massa di ogni peptide quindi avrò una lista delle masse. A questo punto faccio il peptide mass fingerprint cioè identifico la proteina in base al peso molecolare dei peptidi. Interrogo il database da cui ricavo una lista di tutte le masse di tutti i peptidi.

peptidi teorici di tutte le proteine presenti nel database. Faccio un match cioè un confronto con le masse sperimentali e teoriche. Il match si ha quando le masse sono uguali fino a una soglia di tolleranza. Calcolo la probabilità per trovare il numero di match in una proteina per il caso. Traduco il numero in un score = -10 Log(P). Se lo score è maggiore di una soglia arbitraria, allora avrò l'identificazione della proteina.

Quando le masse sperimentali dei peptidi sono una informazione troppo povera, bisogna usare l'aspettrometria di massa tandem. Si fa l'elettrospray della proteina. Misuro la massa dei peptidi. Poi però di tutti i peptidi che arrivano si fa passare un solo valore specifico di m/z. Manda il peptide in una cella di collisione (c'è gas inerte). L'analita collide col gas e si frammenta. I frammenti vanno all'analizzatore e si genera lo spettro di massa di frammentazione.

Faccio lo spettro di massa tipico per

Quel determinato m/z. A ogni peptide associo il suo spettro di frammentazione. Dalle masse dei frammenti posso ricavare la sequenza del peptide. Ogni evento di frammentazione genera due pezzi, l'N-terminale è detto ione b mentre quello al C-terminale è lo ione y. A seconda del punto di frammentazione posso dare una nomenclatura del peptide. È utile per il sequenziamento. Per le modificazioni post-traduzionali, devo vedere peptidi con particolari shift di massa per localizzare le PTM. Interrogo i database. Vedo solo fosforilazioni, ossidazioni, acetilazione, metilazione perché sono piccole.

Assorbanza: L'assorbanza e l'emissione di energia derivano da transizioni di energia di atomi o molecole. Le molecole interagiscono con onde elettromagnetiche di lunghezza specifica, fornendo informazioni sulle strutture molecolari. Le tecniche di spettroscopia misurano l'assorbanza e/o l'emissione di energia da molecole associate alle transizioni dello

stato energetico. Un'onda elettromagnetica ha una doppia natura infatti può essere vista come un fascio di elettroni o una particella. Lambda indica la lunghezza d'onda ed è la distanza tra due picchi successivi. Mentre la frequenza ν indica il numero di onde che attraversano un punto nell'unità di tempo, si misura in s^-1 sec. La velocità della luce è data da lambda per la frequenza. L'energia è data dalla costante di Planck per la frequenza. Ma la frequenza equivale alla velocità della luce fratto lambda. Quindi l'energia è hc/lambda. Nell'atomo il livello di energia più basso si ha per gli elettroni più interni. Per salire di livello energetico, bisogna acquisire energia attraverso un fotone o radiazione elettromagnetica. In un sistema b