Appunti di immunologia e immunopatologia

ITAM.BTK e la sua importanza nell'attivazione dei linfociti B

ITAM.BTK è una tirosina chinasi che svolge un ruolo essenziale nell'attivazione dei linfociti B. Mutazioni a carico di questa proteina possono causare la Agammaglobulinemia. La fosforilazione di ITAM.BTK avvia una cascata segnalatoria che influisce sui fattori di trascrizione della risposta immunitaria.

L'attivazione dei linfociti B può essere influenzata dalla clasterizzazione e da vari fattori, tra cui CD3b del complemento. Questo fattore funge da ponte tra l'immunoglobulina recettoriale e CD21, che è espresso sulla membrana del linfocito B. Il legame di CD3b alla membrana linfocitaria favorisce l'attivazione della cellula B e l'attivazione della cascata segnalatoria.

La cellula B ha anche fattori che contribuiscono alla sua inibizione, come la fosforilazione dei motivi ITIM. A seconda della via di attivazione o inibizione, la cascata segnalatoria può essere basata sulla fosforilazione di ITAM o ITIM. Nel caso della fosforilazione del motivo ITIM, si ha una inibizione della cascata segnalatoria.

proteine attivanti possono essere mandate indegradazione. Alla fine, la fosforilazione citoplasmaticapuò determinare durante l'attivazione l'avvicinamento di quelle proteine che permettono l'entrata in gioco delle proteine linker che adattano la cascata segnalatoria, nella fosforilazione delle ITIM si ha un'alterazione di questa fase precoce e le stesse proteine verrano inviate al proteasoma, per cui si ha variabilità a monte ed una confluenza di segnali che portano all'attivazione o alla degradazione degli stessi fattori.

Il recettore in questi processi è lo stesso e le vie segnalatorie che partono dal recettore determinano l'attivazione o l'inibizione del processo biologico, questo normalmente non si verifica in biologia poiché ogni fattore ha la sua funzione, nella riposta immunitaria invece lo stesso recettore regola i due processi opposti.

GLI ANTICORPI MONOCLONALI

Sono principalmente utilizzati in terapia oncologica, da

quando è stata rivelata la struttura anticorpale si è cominciato a parlare degli anticorpi come strumenti terapeutici. Si parla di risposte umorali mirate verso singoli epitopi antigenici, quindi agiscono singoli cloni linfocitari B; l'anticorpo secreto da una certa popolazione linfocitaria B può subire modificazioni dell'isotipo e quindi va visto come uno strumento dinamico che è in grado di migliorarsi durante l'evoluzione della risposta umorale verso l'epitopo antigenico. Possono riconoscere una sequenza amminoacidica sia in forma lineare che conformazionale, la capacità di poterle produrle in laboratorio è stata una delle tecniche più importanti nella storia della biologia, scoperta da due scienziati Kohler e Milstein nel 1975. In natura non esistono anticorpi monoclonali in quanto gli antigeni hanno più epitopi antigenici eccezione fatta per i linfomi o leucemie a cellule B che determinano una.

Iper-proliferazione e che permettono lo sviluppo di untitolo anticorpale monoclonale. Si conosceva l’esistenza di questi anticorpi monoclonali ma chenon erano utilizzabili in quanto non si conosceva la loro specificità.Paul Erlic per la prima volta parlò di proiettili magici, riferendosi agli anticorpi, nel 1975 sicominciarono a produrre e ad applicare in campo clinico capendone anche i limiti.Tutto si basa su una tecnica estremamente low cost, in vitro, basata sulla produzionedell’ibridoma, è il risultato di una serie di passaggi che mettono in coltura linfociti B in grado diprodurre uno specifico anticorpo. I problemi erano mettere in vitro questi linfociti e mantenerli perun certo periodo di tempo, inoltre si doveva selezionare la popolazione di ibridomi derivanti da unasingola cellula in grado di produrre un anticorpo monoclonale.Si parte da un topolino che viene immunizzato contro unpeptide (ma anche antigeni non proteici) per cui si

vuolerealizzare l'anticorpo. I linfociti B vengono estratti in seguito prelevando la milza e grattandola, a questo punto i linfociti vengono messi in coltura. Per rendere i linfociti immortali produssero gli ibridomi, il risultato di una fusione cellulare tra i linfociti estratti dalla milza e i linfociti B tumorali. Le due popolazioni sono messe insieme con una sostanza chiamata polietilenglicole che promuove la fusione di membrana tra le due cellule, dopo varie selezioni l'ibridoma formato diventa in grado di secernere gli anticorpi contro l'antigene con cui è stato immunizzato il topolino. Queste cellule in grado di secernere gli anticorpi possono essere conservate e stoccate in vitro, per cui si ha una fonte in grado di produrre anticorpi tutti uguali. Questa tecnologia ha aperto la strada per la produzione di qualsiasi anticorpo contro qualsiasi antigene, si devono utilizzare antigeni riconosciuti estranei al sistema immunitario e devono essere immunogeni. Tutti gli

immunogeni sono antigeni ma non tutti gli antigeni sono immunogeni, gli apteni sono antigeni troppo piccoli o che hanno certe conformazioni che divengono immunogeni solo se legati a carrier (albumina, KLH).

In generale il topolino viene infettato con lo stesso antigene almeno 3 volte per aumentare lo switch isotipico e l'affinità anticorpale, solitamente la maggior parte degli anticorpi monoclonali sono IgG. Vengono quindi fatte iniezioni sequenziali con quantità di antigene mano a mano maggiori, in seguito la milza viene isolata e grattata. I linfociti B sono messi in coltura ed in vitro viene eseguita la fusione cellulare con polietilenglicole. Si aspettano circa due settimane in cui viene indotta una selezione, la fusione cellulare non è specifica in quanto il prodotto di fusione sarà costituito da una popolazione eterogenea con prodotti di fusione tra due linfociti B del topolino immunizzato, due cellule tumorali B e l'ibridoma vero e proprio.

selezione degli ibridomi è un altro ostacolo, non tanto l'ibrido linfocito neoplastico-linfocito immunizzato ma l'ibrido tra le due cellule neoplastiche, ingegnerizzarono quest'ultimo in modo che non esprimessero un enzima, ipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasi che è fondamentale per la produzione delle basi puriniche quando il terreno di coltura è addizionato con l'aminopterina che blocca la biosintesi classica dei nucleotidi. Le cellule normali quando questa via è bloccata attivano la transferasi e si possono produrre i nucleotidi a partire da timidina, guanina e ipoxantina esterne, la timidina è convertita dalla timidina chinasi con ATP, l'ipoxantina e la guanina hanno bisogno dell'ipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasi. Gli ibridomi sopravvissuti dopo due settimane in presenza di aminopterina potevano utilizzare la via alternativa, per cui la fusione tra due cellule neoplastiche veniva meno perché veniva

Meno labiosintesi delle purine. Si aveva ottenuto una popolazione policlonale, la milza è l'organo periferico sede principale dei linfociti B che però sono in grado di secernere anticorpi contro tutti gli antigeni incontrati. Successivamente con gli ibridomi sopravvissuti mediante uno screening elisa, ogni terreno di ciascuna popolazione linfocitaria veniva messo a contatto con il pozzetto con il peptide, si inseriva un anticorpo secondario coniugato ad un enzima (perossidasi), si inserisce il substrato dell'enzima per cui si sviluppa un colore dove l'anticorpo secondario ha riconosciuto il primario in quanto l'enzima converte il substrato del pozzetto, questo indica che nel terreno di coltura degli ibridomi era presente l'anticorpo corrispondente in grado di riconoscere il peptide con cui inizialmente era stato immunizzato il topolino. Se si ha la colorazione vuol dire che è presente il complesso peptide-anticorpo primario-anticorpo.

Per ottenere l'anticorpo monoclonale si deve eseguire una clonazione, si sfrutta la capacità di crescita su terreno semisolido tipica delle cellule tumorali. Vengono seminate poche cellule in modo che si distribuiscano separate tra loro, da quelle che riescono a crescere otterremo delle colonie che vengono prelevate ed ognuna sarà una popolazione monoclonale che poi dovrà essere testata per la capacità di secrezione di un unico anticorpo.

Per un utilizzo in clinica non è sufficiente questa tecnica, da una coltura si possono ottenere fino a decine di microgrammi, servono invece grammi di anticorpi che possano essere brevettati e purificati. In passato l'amplificazione veniva fatta su animali inducendo tumori in forma ascitica, per cui il liquido era ricco di anticorpi e veniva siringato ed estratto.

Oggi giorno sono utilizzati bio-reattori in cui l'ibridoma secernente produce grammi di anticorpi in soluzione fisiologica.

Le applicazioni sono nella ricerca di base, dove si possono avere anche anticorpi policlonali; in diagnostica invece è fondamentale avere anticorpi monoclonali. In clinica ci sono pochi anticorpi di origine murina ma molti sono prodotti con tecniche più all'avanguardia, è importante che gli anticorpi siano estremamente specifici. Questa capacità è stata sfruttata nella terapia oncologica, per patologie multifattoriali autoimmuni, per bypassare rigetti da trapianto e per malattie infettive e di carattere cardiovascolare.

Cominciando ad usare questi anticorpi ci si rese conto anche dei loro limiti, il loro effetto diminuiva dopo poche somministrazioni, essendo anticorpi murini erano riconosciuti dal sistema immunitario umano come elementi da distruggere. Si cominciò a parlare di evoluzione degli anticorpi monoclonali con tecniche di ingegneria genetica, ancora oggi alcuni anticorpi sono prodotti con la vecchia tecnica per poi essere ingegnerizzati.

Da quando si scoprì la risposta HAMA, dove l'organismo umano dalla seconda somministrazione produce anticorpi contro gli anticorpi murini, per cui si decise di mantenere murina la parte di riconoscimento dell'anticorpo mentre lo scheletro dell'anticorpo veniva sostituito da quello umano (Fc). Da anticorpi completamente murini si cominciò a produrre anticorpi chimerici dove rimaneva solo la porzione variabile murina e quella costante era sostituita con l'omologa umana. Successivamente si passò agli anticorpi umanizzati dove solo la parte ipervariabile è murina, fino ad arrivare oggi ad anticorpi completamente umani. La risposta umorale è stata la prima ad essere identificata e per prima si è ritagliata un posto nella terapia di varie patologie a carattere multifattoriale ma in particolar modo nella terapia oncologica. Gli stessi tumori possono essere considerati delle patologie multifattoriali, si ha sempre una concomitanza di.

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