Appunti di Genetica

Cenni sulla cellula procariotica

Un procariote è un organismo unicellulare che possiede una struttura relativamente semplice. Nei procarioti il nucleo è assente e il diametro cellulare è relativamente piccolo se comparato con quello degli eucarioti. Solitamente il genoma è costituito da una molecola di DNA circolare, che negli archeobatteri viene complessato dagli istoni, mentre invece questo non avviene negli eubatteri. Nei procarioti non sono presenti organelli. I procarioti comprendono due tipi distinti di batteri:

• Eubatteri
• Archeobatteri

Nonostante eubatteri e archeobatteri siano molto simili strutturalmente, alcuni processi genetici di questi ultimi, come la trascrizione, sono molto più simili a quelli presenti negli eucarioti (da un punto di vista evolutivo gli archeobatteri sono molto più simili agli eucarioti). I geni dei procarioti si trovano collocati perlopiù su una singola molecola circolare di DNA. In ogni caso, è anche vero che diversi batteri hanno geni che si trovano in altre molecole di DNA separate dal cromosoma che si chiamano plasmidi.

Cenni sulla cellula eucariotica

Un eucariote è una struttura cellulare che è divisa in compartimenti da membrane intracellulari. Fra gli eucarioti si trovano sia organismi unicellulari che pluricellulari. Negli eucarioti è presente il nucleo in cui è contenuto tutto il materiale genetico e il diametro cellulare è relativamente grande se comparato con quello della cellula procariotica. Il DNA viene complessato da istoni dando forma alla cromatina. La fase di massima spiralizzazione del DNA è detta cromosoma. I geni degli eucarioti sono localizzati su più molecole di DNA, in particolare su più cromosomi. Alcuni geni, però, possono essere localizzati anche in molecole di DNA circolari presenti in alcuni organelli.

La divisione cellulare nei procarioti

Contrariamente a quanto si può pensare, in un organismo procariote sono presenti diverse molecole di DNA che hanno funzioni differenti:

• Replicone: È un termine generale che si riferisce ad una qualsiasi molecola di DNA. Tecnicamente si riferisce a molecole di DNA con una singola origine di replicazione, con l’eccezione di diversi cromosomi degli Archei.
• Cromosoma: Il replicone principale contiene quasi tutti i geni essenziali per la vita della cellula. Molti batteri contengono più di un cromosoma. I cromosomi possono essere circolari o lineari.
• Plasmide: È un elemento genetico extracromosomico capace di replicarsi in modo indipendente dal cromosoma. Il plasmide si trova all'interno del citoplasma, ma può integrarsi nel cromosoma batterico (in questo caso il plasmide viene detto episoma). I plasmidi non portano geni essenziali per la vita della cellula e sono presenti in più copie nel citoplasma.
• Megaplasmide: È un plasmide di grandi dimensioni oltre 350 KB che non porta geni essenziali per la vita della cellula.
• Cromide: È una molecola intermedia tra un cromosoma e un megaplasmide e porta almeno un gene essenziale.

Queste molecole di DNA sono tutte a doppio filamento e sono tutte in grado di replicarsi poiché sono repliconi.

La scissione binaria

Inizia nel momento in cui sono presenti nell’ambiente cellulare i nutrienti necessari per poter far avvenire la divisione. Quando la cellula si trova in tali condizioni inizia ad aumentare il proprio volume cellulare e a dividersi. Questo avviene grazie ad una segnalazione intramolecolare dovuta a varie molecole, come ad esempio i fattori di crescita. Per far in modo che da una cellula se ne ottengano due identiche c’è bisogno di replicare il materiale genetico, in particolare il cromosoma ed i plasmidi. Una volta che il materiale genetico si è replicato, questo viene trasportato ai poli della cellula e a questo punto inizia la citodieresi, cioè la "strozzatura" della parte centrale della cellula che forma un setto che va a separare il citoplasma delle due cellule. Dopo che è avvenuto tale processo, le due cellule uguali si separano diventando due cellule distinte, che sono dette cloni. La velocità con cui si duplicano le cellule è strettamente dipendente dalla presenza di nutrienti; tanto più questi saranno presenti e tanto più sarà veloce il processo replicativo caratterizzante la colonia batterica. Un altro fattore che può influenzare la velocità di replicazione è la dimensione del cromosoma: più questo è grande e più sarà lento il processo.

La divisione cellulare degli eucarioti

La mitosi

È un processo molto più complicato rispetto alla scissione binaria dei procarioti. In questo processo si ottiene una cellula figlia che è esattamente identica a quella madre. Il DNA si duplica nella fase S del ciclo cellulare. La fase S è preceduta dalla fase G1, in cui la cellula cresce prima di andare incontro alla divisione cellulare. Dopo la fase S, in cui si duplica il DNA, segue la fase G2, in cui la cellula si prepara alla divisione cellulare. Le fasi G1, S e G2 costituiscono l'interfase del ciclo cellulare. Alla fase G2 segue la fase M (cioè mitosi), che è suddivisa a sua volta in altre quattro fasi che sono la profase, la metafase, l’anafase, la telofase, seguita poi dalla citocinesi in cui avviene la divisione cellulare vera e propria.

Quando la cellula è in fase G1, il DNA si trova complessato da istoni sotto forma di cromatina. La cromatina può esistere in due tipi: eucromatina ed eterocromatina. La principale differenza fra le due è che la prima è poco complessata (sono presenti pochi istoni) mentre invece la seconda è più complessata (sono presenti più istoni) e appare più scura al microscopio. L’eucromatina corrisponde a quelle regioni del DNA che sono attive dal punto di vista trascrizionale (si trascrive RNA) mentre invece l’eterocromatina è inattiva.

Con il procedere di G1, il DNA inizia ad addensarsi spiralizzandosi in cromosomi costituiti da due cromatidi fratelli. Il primo passaggio della mitosi è la profase iniziale. In questa fase, i centrioli si separano e i cromosomi iniziano ad accorciarsi ed inspessirsi e il nucleolo inizia a scomparire. Nella fase successiva, che possiamo chiamare profase intermedia, i centrioli si spostano ai lati della cellula e cominciano a formarsi le fibre del fuso mitotico, i cromosomi a loro volta diventano più visibili. Nella profase avanzata, i centrioli raggiungono i poli della cellula, si ultima la costruzione del fuso mitotico che si ancora ai cromosomi e la membrana nucleare inizia a dissolversi. In questa fase, il cromosoma è composto da due porzioni di DNA identiche dal punto di vista genetico che si chiamano cromatidi fratelli e sono uniti fra loro da una regione che si chiama centromero e che ha una struttura, il cinetocoro, alla quale si legano i microtubuli collegati ai due centrioli separati.

Nella seconda fase della fase M del ciclo cellulare, cioè la metafase, la membrana nucleare si dissolve completamente e i cromosomi replicati, tenuti uniti dal centromero, si allineano sulle fibre del fuso mitotico in posizione equatoriale, rispetto alla piastra metafasica, cioè un cromatide è orientato verso un polo e l’altro verso l’altro. Nell’anafase iniziale, i centromeri si dividono e i cromosomi figli incominciano a migrare ai poli opposti. Nell’anafase avanzata, le due serie di cromosomi figli si avvicinano ai poli e inizia la divisione cellulare. L’ultimo processo della fase M è la telofase, che è caratterizzata dalla ricostruzione delle membrane nucleari e del nucleolo, i cromosomi iniziano ad allungarsi divenendo meno visibili e la citocinesi prosegue fino a che le cellule non si separano definitivamente.

Forze in conflitto

Come abbiamo visto, gli organismi sono in grado di dare vita ad una cellula identica a quella di partenza che permette il mantenimento della propria identità biologica, che però entra in conflitto con la necessità di una variabilità genetica che permetta l’evoluzione dei sistemi biologici. Nel corso dei miliardi di anni, le cellule e gli organismi hanno, perciò, adottato diverse strategie e meccanismi per cercare di equilibrare queste due forze in contrasto. Ai primordi, l’equilibrio era di molto spostato verso la variabilità genetica a discapito della conservazione dell’identità biologica. Nel corso del tempo, si sono generate delle cellule con vantaggi evolutivi rispetto alle altre che sono state selezionate ed hanno permesso di mantenere una propria identità biologica limitando gli scambi di DNA nel genoma, permettendo di riequilibrare le due forze in conflitto.

Nei procarioti, il processo che ha portato a questo equilibrio è il trasferimento genetico orizzontale, che è a sua volta suddivisibile in altri quattro processi che sono fondamentali per lo scambio di informazioni genetiche: la trasformazione, la trasduzione, la coniugazione e la fusione cellulare. Negli eucarioti, per mantenere una propria identità biologica e allo stesso tempo continuare ad avere una variabilità genica, si è sviluppato un sistema chiamato riproduzione sessuale in cui si producono particolari cellule, dette gameti, che permettono la variabilità genetica ma anche il mantenimento dell’identità. Il complicato meccanismo che porta alla formazione dei gameti si chiama meiosi.

La meiosi

Processo che genera gameti tutti diversi ed è comparso successivamente alla nascita della mitosi. Analogamente a quanto avviene nella mitosi, il materiale genetico presente nella cellula viene duplicato, in particolare i cromosomi. All’inizio sono visibili i cromosomi già replicati, nella fase mediana della profase 1, i cromosomi omologhi si accorciano e si ispessiscono, vanno incontro a sinapsi e avviene il crossing-over. Nella profase 1 tarda, l’evento di crossing-over viene visualizzato dai chiasmi, la membrana nucleare scompare e l’apparato del fuso inizia a formarsi. Nella metafase 1, l’organizzazione del fuso è completata e ogni paio di cromosomi si dispone sul piano equatoriale del fuso. Nell’anafase 1, i membri di ogni paio cromosomico si separano e migrano verso i poli opposti. Nella telofase 1, i cromosomi, ciascuno costituito da due cromatidi fratelli, completano la migrazione ai poli e le nuove membrane nucleari si riformano. La principale differenza con la mitosi è che gli interi cromosomi vengono trasportati ai poli dopo che hanno subito il crossing-over.

Dopodiché avviene la citocinesi, formando due cellule con corredo cromosomico dimezzato. A questo punto si ha una seconda divisione meiotica con una profase 2 che segue le stesse procedure della prima. I cromosomi presenti nella cellula a seguito della prima divisione meiotica rimangono gli stessi e nella metafase 2 si dispongono in senso equatoriale con ognuno dei cromatidi fratelli rivolti verso poli opposti, come nella mitosi. Durante l'anafase 2, i due cromatidi si dividono e vengono trasportati ai poli opposti della cellula. Nella telofase 2, la membrana nucleare si riforma e inizia la citocinesi per entrambe le cellule che precedentemente si sono divise. In conclusione, dalla prima divisione meiotica si ottengono due cellule con corredo cromosomico dimezzato e nella seconda si ottengono quattro gameti derivati dalla divisione delle due cellule precedenti. Questi gameti potranno poi fondersi con gli altri gameti del sesso opposto per dare origine ad un nuovo individuo.

Confrontando mitosi e meiosi possiamo vedere come il passaggio determinante sia la metafase (o metafase 1 nella meiosi). Nella mitosi i cromosomi duplicati si allineano indipendentemente sul fuso, mentre invece nella meiosi le coppie di cromosomi omologhi duplicati si allineano appaiati sul fuso. Ne consegue che il processo di anafase è molto diverso fra mitosi e meiosi. Nella mitosi, ai poli opposti si attirano i cromatidi fratelli, mentre nella meiosi vengono attirati ai poli opposti gli interi cromosomi ricombinati. Con la meiosi quindi si ha il dimezzamento del numero di cromosomi.

Per aploide (N) si intende una cellula che contiene una copia di ogni singolo cromosoma.

Per diploide (2N) si intende una cellula che contiene due copie di ogni singolo cromosoma.

La meiosi permette la variabilità genetica attraverso nuove combinazioni genetiche che avvengono mediante ricombinazione. Esistono due tipi di ricombinazione genetica:

• Ricombinazione inter-cromosomica: Inizialmente si ha l'assortimento indipendente dei cromosomi omologhi paterni e materni durante la divisione meiotica 1. A seconda di come i cromosomi sono assortiti, i cromatidi corrispondenti dei quattro gameti potranno provenire sia dalla serie materna che paterna. Questo fa sì che si possano ottenere 16 combinazioni di gameti possibili fra i quattro che si formeranno.
• Ricombinazione intra-cromosomica: I cromosomi omologhi, uno di origine materna e uno di origine paterna, si appaiano e su di loro agisce la proteina ricombinasi RecA che taglia i due cromosomi in due punti esatti e uguali tra loro e scambia queste parti di cromosoma fra loro, in questo modo entrambi i cromosomi omologhi hanno una porzione di materiale genetico proveniente dall'altro. Questo processo si chiama crossing-over.

RecA nel crossing-over riconosce delle regioni particolari a doppio filamento nei cromosomi omologhi. A questo punto taglia una regione del cromosoma paterno e lo scambia con quello materno e viceversa. Il fatto che si tagli una regione significa che il taglio avviene su diverse doppie eliche di DNA e queste verranno poi ricucite nel cromosoma omologo.

Il materiale genetico

L’esperimento di Griffith e la scoperta del Principio Trasformante

Griffith concentrò i suoi studi nello streptococcus pneumoniae, un batterio responsabile della polmonite. Egli utilizzò due diversi ceppi del batterio, uno chiamato S che si aggregava in una colonia dall’aspetto liscio e lucente e l’altro R che dava origine a colonie differenti da S che avevano un aspetto rugoso ed inoltre il ceppo R non era infettivo a differenza del primo (non provocava la polmonite). L’infettività del ceppo S è dovuta alla presenza di un involucro polisaccaridico che avvolge ogni singola cellula (l’involucro determina anche l’aspetto lucente della colonia). Il ceppo R si differenzia da S per la presenza di una mutazione a livello del genoma che non permette la creazione dell’involucro.

L’esperimento di Griffith venne suddiviso in quattro fasi:

• Nella prima fase iniettò il ceppo R vivo all’interno di un topo. Il topo sopravvisse all’iniezione e poi ne prelevò il sangue constatando che all’interno dell’organismo del topo non era presente tale ceppo batterico.
• Nella seconda fase iniettò il ceppo S vivo all’interno di un topo. Il topo a seguito della iniezione si ammalò e morì di polmonite. Prelevandone il sangue osservò la presenza del ceppo S.
• Nella terza fase utilizzò il ceppo vivo S e lo espose a calore uccidendo la colonia che fu poi iniettata su un topo. Il topo sopravvisse all’iniezione e prelevandone il sangue non trovò traccia del ceppo S, constatando che per essere infettivo, il batterio, doveva essere necessariamente vivo.
• Nella quarta fase unì il ceppo R vivo e il ceppo S ucciso dal calore e iniettò la miscela in un topo, aspettandosi che questo sopravvivesse. In realtà, il topo morì di polmonite e nel sangue lo scienziato trovò tracce di batteri S. Immaginandosi di non aver inizialmente ucciso tutti i batteri S con il calore, decise di ripetere la quarta fase più volte, ma questa ebbe sempre lo stesso esito.

Dall’analisi degli esiti della quarta fase, Griffith immaginò l’esistenza di un agente in grado di trasformare i batteri R in batteri S e che questo provenisse dal ceppo S rendesse l’altro gruppo in grado di essere infettivo. A questo agente venne attribuito il nome di principio trasformante e inizialmente si pensò che fosse di origine proteica, ma con lo sviluppo della genetica venne identificato come la molecola di DNA.

L’esperimento di Avery e i suoi collaboratori

In seguito all’esperimento di Griffith, i ricercatori cercarono di individuare la natura del principio trasformante. Questi si focalizzarono sullo studio di macromolecole presenti nella cellula, cioè proteine, polisaccaridi, grassi ed infine acidi nucleici (DNA ed RNA). Poiché le proteine presentano una struttura più complessa e variegata rispetto alle altre macromolecole, i ricercatori pensarono inizialmente che queste fossero legate al principio trasformante. L’esperimento di Avery riprese le ricerche effettuate da Griffith utilizzando gli stessi ceppi batterici. Avery e i suoi collaboratori utilizzarono una piastra batterica in cui furono seminati i ceppi S e immisero gli stessi all’interno di una beuta contenente una soluzione sostanze. In seguito prepararono l’estratto cellulare totale, cioè le cellule vennero “distrutte” in modo da rilasciare all’interno del contenitore tutte le macromolecole presenti nelle cellule. A questo punto gli scienziati isolarono le diverse macromolecole presenti nel contenitore, frazionandole in cinque provette differenti contenenti rispettivamente proteine, RNA, DNA, lipidi e polisaccaridi. Oltre a queste, era presente anche una sesta provetta in cui non era presente nessuna macromolecola e costituiva, dunque, la provetta di controllo. Nel successivo passaggio, in ognuna delle provette, vennero aggiunte le cellule R vive in modo tale da capire in quale di queste...