Genetica - Appunti

Genetica resistenza insetti

Basi genetiche della resistenza agli antiparassitari

Il contenuto del corso riguarda le basi genetiche della resistenza agli antiparassitari, erbicidi, si troveranno tutta una serie di parole che sono sinonimi dal punto di vista del vocabolario, meno sinonime dal punto di vista della commercializzazione del prodotto perché adesso come adesso dal punto di vista legislativo si parla di agro farmaci che ha sostituito il termine di fitofarmaci che ha sostituito il termine di insetticida o antiparassitario. Sono tutta una serie di termini che stanno a sottostare allo stesso prodotto però è chiaro che stanno a sottintendere a due strategie: una positiva e l’altra commerciale.

La strategia positiva che vedremo dopo su quella che è l'evoluzione del prodotto che viene utilizzato per contrastare l'infestazione dei fitofagi ha subito un'evoluzione da prodotti con caratteristiche generiche quindi che nuocevano tanto all'insetto bersaglio quanto all'operatore e a tutto l'ambiente all'interno del quale questi prodotti venivano utilizzati. Questa tipologia di prodotto è stata largamente sostituita dalla tipologia di prodotto che è sempre più mirato nei confronti del bersaglio, con grossi vantaggi ambientali.

Il primo obiettivo degli antiparassitari è stato anche distinguere in maniera netta l'operatore uomo rispetto al bersaglio che in genere è rappresentato da un insetto. Non è così banale, all'inizio la distinzione non era così netta e non solo, ancora per una buona parte di prodotti che vengono utilizzati sono prodotti che sono fortemente tossici per l'operatore. Certamente la dose è diversa, mentre sono tossici a livello di ppm per l'insetto bersaglio, sono tossici a livello di grammi per l’operatore.

L’evoluzione del prodotto dal punto di vista del bersaglio è sempre più mirata anche poi perché all'interno degli stessi insetti si sta pensando, in alcuni casi si riesce a fare una discriminazione in maniera tale da rendere commerciali i prodotti che uccidono i fitofagi e rispettano gli insetti utili. Questi sono i prodotti di terza e quarta generazione che sono studiati per interferire con il metabolismo degli insetti fitofagi cercando il più possibile di rispettare quelli che sono gli insetti utili.

Evoluzione della terminologia e marketing

Da questo punto di vista il fatto che l'evoluzione del prodotto sia andata di pari passo con l'evoluzione della denominazione ha un certo senso. Da pesticida/insetticida in senso lato ad agro farmaco ha nella sua accezione positiva il fatto di stare a testimoniare questa maggiore attenzione per quelli che non sono gli insetti bersaglio. Certamente ha anche una strategia di marketing perché è banale sottolineare l'impatto diverso che può avere il termine insetticida, pesticida con il termine agro farmaco. È un messaggio molto diverso, quindi un'evoluzione che ha tutta una serie di effetti positivi, può avere l'effetto negativo o solamente un aspetto di marketing il fatto di dare questa denominazione.

Tutti questi prodotti non hanno ancora risolto il problema della resistenza all'utilizzo di questi prodotti. Innanzitutto vediamo che c'è una definizione di agro farmaco che è una sostanza atta a prevenire o a indebolire insetti animali o vegetali indesiderabili e nocivi. È chiaro che se si parla di insetticidi li dobbiamo distinguere rispetto agli erbicidi.

Artropodi e resistenza

Quando si parla di insetti nel campo della resistenza si intende artropodi in senso lato, rientrano in questa categoria anche gli acari. Nel campo degli acari c'è un discorso interessante perché all'interno del taxa degli acari ci sono degli acari che sono utili perché sono predatori o parassiti degli afidi così come invece ci sono acari che sono fitofagi e quindi danneggiano le piante. Quindi anche in questo caso si capisce quanto possa essere problematico e quanto livore ci potrebbe essere per cercare di mettere sul mercato dei prodotti che abbiano un target sempre più preciso.

Per esempio, all'interno degli acari si dovrebbe formulare un prodotto che cerchi di rispettare quegli acari che sono parassiti degli afidi quindi svolgono un'azione utile per quanto riguarda il controllo dell'infestazione atipiche rispetto invece a quegli acari che essendo fitofagi sono in grado di determinare dei danni. Però questo è un problema non da poco perché c'è sempre alla base un discorso di tipo economico, uno sviluppo di un nuovo prodotto antiparassitario si parla di 150.000.000 di euro. Stiamo parlando di un prodotto che abbia le caratteristiche nel 2007 per poter essere lanciato sul mercato, quindi un prodotto che sia il più possibile specifico per l'insetto bersaglio e che sia il più possibile rispettoso per l'ambiente.

Problemi economici e riduzione dei principi attivi

Il fenomeno della resistenza si deve confrontare quotidianamente perché il fatto che costi tanto lanciare un prodotto nuovo si sta fortemente riducendo il numero di principi attivi che sono disponibili sul mercato per poter contrastare i fitofagi e questo è un problema. I lati positivi sono quelli che non vengono più lanciati dei prodotti ad azione generalizzata, ma con azione mirata e che rispettino l'ambiente. Ma dal punto di vista di chi si deve occupare di strategie di sviluppo della resistenza il problema di avere una forte riduzione del numero di prodotti utilizzati è un grosso problema perché il primo presupposto per rallentare l'insorgenza di fenomeni della resistenza è quello di potere utilizzare e alternare una vasta gamma di prodotti. Se io invece ho un numero sempre più ridotto di principi attivi che possono funzionare è chiaro che il fenomeno della resistenza si risolve con la maggior facilità.

Variabilità genetica e mutazione

Il fenomeno della resistenza non è altro che una forma artificiale negativa nei confronti del risultato finale nel senso che in una popolazione di un qualunque fitofago esiste per forza di cose così come esiste la variabilità genetica, proprio perché esiste la variabilità genetica esiste in una qualunque popolazione di fitofagi una frazione magari ridottissima di individui che sono naturalmente resistenti nei confronti del prodotto che viene utilizzato. La base genetica della resistenza è la variabilità genetica, è la mutazione.

Qual è il problema per il quale si passa da un fatto positivo cioè una naturale sorgente di variabilità genetica nel caso dell'insorgenza della resistenza (elemento estremamente negativo)? Il problema nasce dal fatto che andando ad utilizzare un prodotto con una certa continuità andiamo a selezionare artificialmente quei pochissimi individui che in condizioni naturali verrebbero magari eliminati perché da tenere conto che sulla base della variabilità genetica è praticamente impossibile che non ci siano dei fenomeni di resistenza naturale prima ancora che venga introdotto il principio attivo.

In genere però questi resistenti naturali rappresentano una frazione estremamente ridotta rispetto alla popolazione generale in assenza della pressione di selezione prodotta dall’anti parassitario semplicemente perché di regola questi individui che sono naturalmente resistenti hanno un costo in termini di fitness. Un individuo che presenta una mutazione che conferisce resistenza ad un principio attivo spesso ha una fitness più ridotta rispetto all'individuo wild type. In un ambiente naturale non sottoposto a trattamenti il numero di questi individui resistenti viene tenuto sotto controllo dal fatto che hanno una fitness più ridotta.

Se noi andiamo ad alterare questo equilibrio introducendo un principio attivo otteniamo un fenomeno di selezione artificiale che va a vantaggio degli individui mutati rispetto a quelli wild type e questo è un circuito che non ha soluzione. Non esiste la possibilità di eliminare il problema della resistenza, esiste invece la possibilità di convivere con la resistenza in maniera tale che questi individui resistenti non superino mai una determinata soglia tale da arrivare al danneggiamento del prodotto.

L'errore maggiore che un principiante può commettere quando si trova ad affrontare il problema della resistenza agli anti parassitari è quello di pretendere di eradicarla perché per fare questo dovrebbe utilizzare una enorme quantità di prodotto che rischierebbe di portare a una contro selezione di quegli individui che sono naturalmente resistenti e quindi la soluzione più frequente di fronte a questi problemi è quella di tenere sotto controllo la resistenza in maniera tale che non si superi mai un determinato valore soglia che è quello che comporta il danno economico.

Mutazioni e resistenza metabolica

Una delle mutazioni più frequenti che andremo a studiare nel dettaglio, le basi genetiche della resistenza possono essere le più svariate però grosso modo i due ambiti maggiori riguardano:

• Resistenza dovuta ad attivazioni di vie metaboliche alternative quindi la resistenza di tipo metabolico.
• Resistenza target site cioè la resistenza legata a mutazioni specifiche in un punto di un gene che è coinvolto in un passaggio tale per quanto riguarda la fisiologia di quel determinato insetto.

Per quanto riguarda la resistenza metabolica è un autentico problema perché in genere la resistenza metabolica è legata alla presenza di vie metaboliche di detossificazione delle sostanze esogene che non è una via metabolica selezionata solo in funzione della resistenza, esistono in qualunque organismo dei naturali sistemi di detossificazione che sono ad esempio le ossidasi a funzione mista, i sistemi gsp, citocromo P450 etc. Questi sono sistemi che sono naturalmente presenti nei diversi individui che hanno il compito di favorire l’eliminazione e l’escrezione di sostanze riconosciute come sostanze esogene potenzialmente pericolose.

È chiaro che in individui resistenti a un determinato agro farmaco queste vie metaboliche sono molto più attive rispetto a quelle degli individui sensibili e questo è il problema più complesso da affrontare quando si lavora in campo. Molto più semplice è il meccanismo delle mutazioni target site cioè delle mutazioni dovute alla sostituzione anche di un singolo nucleotide in un determinato gene.

Bersagli degli antiparassitari

Per esempio, uno dei bersagli classici di una serie di prodotti anti parassitari è l’acetil colina esterasi che è un enzima che funziona a livello dello spazio inter sinaptico che ha il compito di eliminare l’acetil colina che è un mediatore chimico dell’impulso nervoso. Bloccare l'attivazione dell'impulso nervoso vuol dire portare a morte l'individuo. Ci sono tutta una serie mutazioni del gene dell’acetil colina esterasi che bloccano la funzione dell’acetil colina esterasi, l’acetil colina rimane nello spazio inter sinaptico per tempi lunghi e arriva a stimolare troppo la terminazione nervosa che dopo un certo periodo va in tilt, si blocca e si ha la morte dell’individuo. Quindi, mutazioni a carico del gene dell’acetil colina esterasi portano a morte dell’individuo, l’acetil colina esterasi è il target per una serie di prodotti anti parassitari. Cioè, io ad esempio somministro un organo fosforico, un carbammato, ci sono una serie di insetticidi che vanno a bloccare l’attività dell’acetil colina esterasica ottenendo la morte dell’individuo.

Esistono degli individui resistenti che hanno una mutazione a carico del gene dell’acetil colina esterasi che lo rende insensibile cioè non avviene il contatto tra l’anti parassitario e il sito bersaglio dell’acetil colina esterasi perché in questi individui la mutazione target site ha modificato il sito bersaglio quindi non c’è una interazione e questi sono individui resistenti. In assenza di pressione di selezione in genere questa mutazione che conferisce resistenza cioè impossibilità di legame tra anti parassitario e sito bersaglio, questa mutazione ha un costo in termini di fitness cioè hanno una acetil colina esterasi modificata che è meno efficiente rispetto all’acetil colina esterasi che è presente negli individui wild type.

Quindi, in condizioni naturali quando compare una mutazione nell’acetil colina esterasi questi individui hanno resistenza ai prodotti, ma hanno anche una fitness più ridotta perché hanno una acetil colina esterasi meno efficiente. In assenza di pressione di selezione vengono eliminati, in presenza della pressione di selezione determinata dall’antiparassitario il discorso cambia e per quanto abbiano una fitness più ridotta però non essendo sensibili al trattamento sopravvivono laddove gli individui sensibili vengono eliminati.

Classificazione degli insetticidi

Grosso modo andiamo a dare una classificazione per quanto riguarda gli insetticidi, un bersaglio ve lo ho anticipato, un bersaglio classico degli insetticidi è rappresentato dagli anti colinesterasici che sono quei farmaci che agiscono a livello dell’acetil colina esterasi inibendo l’idrolisi dell’acetilcolina e perciò provocando un accumulo della stessa nello spazio inter sinaptico e questo si traduce in iperstimolazione e quindi nella morte dell’individuo stesso.

Recettori colinergici sono presenti a livello del sistema nervoso autonomo, nella giunzione neuromuscolare e nell’encefalo. All’interno di questa categoria i prodotti più diffusi sono gli organo fosforici e i carbammati, entrambi hanno una conformazione sterica tale da andare a legarsi al sito attivo, al sito catalitico dell’acetil colina esterasi, si legano in maniera costante, vanno a formare un legame stabile che blocca completamente la funzionalità dell’enzima stesso. Purtroppo hanno anche conseguenze negative in termini di inquinamento ambientale perché tendono ad accumularsi nei campi e non sono strettamente specie specifici e quindi certamente non sono pericolosi per l’uomo, ma possono essere pericolosi per gli insetti utili e per altri organismi presenti in quello stesso ambiente, per di più potendo accumularsi nel terreno possono avere un effetto prolungato nel tempo.

L’altra categoria è quella degli organo clorurati il cui capostipite è il DDT che vedremo più avanti, gli organo clorurati hanno una stabilità chimica enorme e una lenta bio trasformazione, questo è il loro pregio, ma anche il loro difetto perché essendo molto stabili permangono nel tempo e quindi possono esercitare un’azione prolungata e questo nei confronti degli insetti bersaglio è un fatto positivo, nei confronti dell’ambiente è un problema perché dal punto di vista ambientale sarebbe meglio usare prodotti che una volta esaurito il loro effetto non trovarli più nell’ambiente. Sono composti lipo solubili che si accumulano nei campi, per di più il problema maggiore è che si accumulano anche nel grasso animale con tante ricadute negative, il loro bersaglio sono i canali del sodio, anche i canali dei sodio sono coinvolti nello stimolo nervoso e la presenza di questi antiparassitari comporta una riduzione della velocità e della ripolarizzazione con aumento della sensibilità a piccoli stimoli, in pratica alterano pesantemente la conduzione dello stimolo nervoso.

Anche i piretroidi agiscono a livello dei canali dei sodio, i piretroidi sono dei derivati sintetici da neurotossine vegetali naturali, dal piretro prodotto dal crisantemo, i semi di crisantemo hanno una grossa concentrazione di pietrine che sono dei principi attivi abbastanza efficaci. I piretroidi sono molto più efficaci perché partono da questa molecola e la modificano in modo tale da renderla più stabile quindi più attiva. I piretroidi sono molto interessanti perché sono tra i pochi prodotti che proprio perché sono direttamente naturali o di stretta derivazione delle molecole naturali e sono anche concessi nell’agricoltura biologica, quindi è un prodotto molto interessante, purtroppo però nei confronti dei quali si sono sviluppati vari meccanismi di resistenza.

Poi ci sono i prodotti direttamente botanici: i piretroidi, la nicotina, i rotenoidi cioè sono dei prodotti che sono più vicini alle situazioni naturali e che quindi sono utilizzati e permessi nelle coltivazioni biologiche.

Evoluzione degli insetticidi

Il problema del controllo degli insetti nocivi non è un problema che è nato oggi, è un problema affrontato nel 1.000 avanti Cristo citato negli scritti di Omero. Qual è l’evoluzione che hanno subito questi prodotti? L’evoluzione è quella che si è passati da sostanze a spettro amplissimo ed erano tanto pericolose per gli insetti bersaglio quanto per l’operatore e per l’uomo tipo per esempio l’arsenico, lo zolfo etc. Si è passati a insetticidi e nel periodo del 19° secolo si è un pochino ristretto il campo d’azione, sicuramente sono stati eliminati i derivati diretti dell’arsenico, si è passati al cloruro, ai saponi, ai cherosene e poi andando avanti nell’evoluzione dei prodotti dagli insetticidi di prima generazione si è passato agli insetticidi di seconda generazione che cercavano di modificare la specificità per l’insetto bersaglio soprattutto la novità è che tutti i prodotti che erano presenti nella diapositiva precedente erano prodotti di origine naturale.

Siano essi di origine vegetale che di origine minerale come zolfo, gesso, arsenico però erano prodotti che venivano recuperati e così come venivano recuperati vengono utilizzati ed è chiaro che dal ventesimo secolo si è passati alla sintesi di prodotti cioè identificata una determinata molecola che costituisce il principio attivo dei prodotti naturali e si è arrivati alla possibilità di modificare la composizione chimica di questi prodotti in maniera tale da migliorare l’efficacia nei confronti dei bersagli e ridurre l’efficacia nei confronti del resto dell’ambiente.