Appunti di Biologia molecolare

REPRESSORE LAMBDA

Se vengono rimossi i repressori lambda, le polimerasi riprendono la trascrizione riconoscendo i promotori.

Il repressore lambda è una proteina di 27 kDa con 2 domini:

• Dominio N-t ha un motivo strutturale per riconoscere i suoi siti bersaglio con il DNA;
• Dominio C-t ha il compito di dimerizzare due monomeri.

Il connettore unisce i due domini, che sono funzionalmente indipendenti. Questo significa che se produco una proteina ricombinante tronca esprimendo solo il dominio C-t, le caratteristiche della proteina wild-type e di quella tronca sono le stesse. Questo è dovuto al fatto che l'efficienza di legame di un monomero al DNA è molto bassa mentre l'affinità e la forza di legame aumentano con la dimerizzazione grazie al fatto che si può contattare contemporaneamente il DNA con due domini N-t. La proteina dimerica, a differenza della monomerica, lega in maniera molto forte il DNA.

Se distruggiamo la capacità di...

è di controllare gli eventi di ricombinazione ma ha anche la funzione che, seA”).aumenta la concentrazione di frammenti di DNA, gli acidi nucleici danneggiati la contattano e ne attivano la funzioneproteasica.

Il sito di legame del dimero del repressore è una sequenza palindromica, ripetuta e invertita, rispetto ad un asse disimmetria ed è lunga 17 bp. La sequenza ripetuta è imperfetta. Se guardiamo la struttura della proteina, notiamo chevi è una serie di α-eliche. L’α-elicanel dominio N-t 3 è costituita da 9 aminoacidi ed è detta elica di riconoscimento etrasversalmente a questa vi è l’α-elica 2 di 7 aminoacidi. Queste due eliche costituiscono il tipico motivo struttura HTHper legare il DNA e sono l’una trasversale all’altra. La dimerizzazione porta le due eliche 3 dei due(elica-giro-elica)monomeri a 34 Å di distanza, il che permette loro di adattarsi in scanalature

principali successive del DNA.I contatti tra l'elica-3 e l'elica-2 sono mantenuti da interazioni fra aminoacidi idrofobici.

Scienze biologiche, unibo FML'elica-3 riconosce e lega le basi nel sito di legame (solco maggiore del DNA), formando dei legami H tra le catenelaterali degli aminoacidi e le posizioni esposte delle coppie di basi. Il repressore lambda e la proteina cro selezionanosequenze bersaglio diverse perché hanno alcuni aminoacidi diversi nell'elica-3. La proteina cro è una piccola proteina di9 kDa che è in grado di dimerizzare e ha un dominio di legame al DNA simile a quello del repressore lambda. Croriconosce gli operatori sia di sinistra che di destra: la forza di legame è più bassa e preferisce delle sequenze diverserispetto a quelle "scelte" dal repressore lambda. La stessa sequenza nucleotidica può essere bersaglio sia di cI che dicro, creando una specie di competizione per dei siti.

punto d'inizio dellae anche O è costituito da 3 siti di legame (O 1, O 2 e O 3). L L L L trascrizione nel promotore, i siti 2 e 3 sono più a monte. I siti di legame di ciascun operatore sono separati da spaziatori lunghi poche bp. Questi siti sono riconosciuti e legati dal repressore lambda: il legame di un dimero su O 1 (è il sito che ha maggiore affinità per il repressore) stimola il legame di un altro dimero su O 2 (ha affinità minore rispetto al primo sito). Lo stesso avviene a livello di O . L1 contatta l'altro dimero sul sito a fianco (O 2), aumentando l'affinità per il DNA di Il legame di un primo dimero su O R R circa 8-10 volte. Il repressore si lega ai successivi siti di ciascun operatore in maniera cooperativa. Questo fenomeno prende il nome di cooperatività. I domini C-t dei monomeri di un dimero interagiscono con i domini C-t di un altro dimero: sul DNA si forma quindi un tetramero (non prima). I siti degli

operatori O 1 e O 1 si sovrappongono ai promotori P e P : la polimerasi non lega il promotore perché èR L R Lc'è il promotore P : il legame del secondo dimero sull'operatore occupato dai repressori. Alle spalle del promotore P R RMO 2 reprime totalmente la trascrizione verso destra e si attiva quella del promotore P del gene cI. Questo gene èR RMmolto poco espresso, basta mantenere una quantità di repressore necessaria e sufficiente a portare avanti la via lisogena. Questo è dovuto al fatto che il legame cooperativo aumenta l'affinità effettiva del repressore per l'operatore: il repressore è quindi sufficiente anche a concentrazioni basse per occupare l'operatore.

57Scienze biologiche, unibo FMAUTOREGOLAZIONE DEL REPRESSORE LAMBDAL'mRNA del repressore lambda codificato dal gene cI inizia con AUG ma manca di un sito di legame per il ribosoma: è un messaggero molto scadente che viene trascritto

polimerasi (a livello della regione che prende contatto con la regione -35 basica").possono rilasciare energia, che viene usata per aiutare l'inizio dellainterazioni proteina-proteina trascrizione: il contattodel repressore e fattore σ70tra dominio N-t della polimerasi favorisce la transizione da complesso chiuso a complessoaperto della polimerasi.Il legame cooperativo è quindi necessario per inibire la trascrizione del genoma fagico e attivare solo il gene cI. Finchè è disponibile una quantità di repressore sufficiente a saturare O 2, la polimerasi continuerà a trascrivere il gene cI.RI tetrameri sugli operatori O 1 e O 2 interagiscono con gli operatori O 1 e O 2, formando un ottamero e determinandoL L R Ril ripiegamento del DNA ad ansa. In questo modo, il DNA è bloccato in una sottospecie di lucchetto. Questo statorepresso è molto sensibile alla concentrazione di repressore lambda: basta una minima quantità di

Essere paradossale ma c'è una soluzione. Se il promotore P per codificare il gene cI viene attivato dal legame del dimero di repressore lambda al secondo operatore, ci deve essere un altro meccanismo per esprimere la prima volta il repressore.

Il primo evento dopo l'infezione è la trascrizione dei geni N e cro. La proteina pN permette alla trascrizione di estendersi oltre i terminatori. Dopo il gene cro, abbiamo (a destra) il gene cII e (a sinistra) il gene cIII.

I geni cII e cIII sono regolatori positivi i cui prodotti sono necessari per dare inizio all'espressione di cI ma non sono necessari per l'espressione continuativa del repressore. La proteina cII è quindi un attivatore trascrizionale che agisce direttamente sull'espressione genica, reclutando la polimerasi sul promotore P positivo. Il secondo promotore P di cI è molto scassato: ha una sequenza -10 poco simile a quella consenso e manca della sequenza -35.