Appunti di Biologia molecolare

Biologia Molecolare

Biologia Molecolare

Lezione 1 - Introduzione

30/11/2022

Cosa si impara in questo corso?

• Leggere le informazioni genetiche, contenute nello zigote e da lì sviluppata ed eseguita.
• Scoperte della biologia molecolare.
• Esempio pratica: codici esempio.
• Informazioni genetiche sono trascritte ed espresse.

È possibile identificare il proprietario di un campione biologico? (capello, saliva,...)

• Non è possibile prevedere magicamente.
• Solo se si ha il consenso.

È possibile conservare un intero organismo in un solo blocco di ghiaccio?

• Sì, è stato fatto. Per esempio, i esperimenti riguardo alla risoluzione genetica.

Ma quindi, che cos’è la biologia molecolare?

• Scienza che studia i dettagli molecolari dei processi biologici.
• Cura delle malattie genetiche.

Le basi arrivano da Gregor Mendel: Che cos’è un gene?

• Trasmissione del fenotipo
• Teoria: Consistenza, distinzione, separazione.

Quale definizione di gene è universalmente valida?

• Gene = Tipologie di carattere discreto.

Quale affermazione sull'evoluzione è corretta?

• Tesi evolutive.
• Evoluzione: gli organismi si evolvono per adattarsi ai cambiamenti dell’ambiente.

Se interpretiamo la resistenza come una mutazione, che cosa ha dato la mutazione al ceppo R che il ceppo S non ha?

• Capsula proteica sul batterio che impedisce l'entrata del materiale virale. Esatto!
• Il virus può mutare altrimenti e colpire pure la capsula scadente?

DNA virale R non riesce ad entrare nel batterio oppure entra ma non riesce a replicarsi.

• Mancano geni per la replica
• Protetti da invasione
• DNA tagliato dal batterio

Il DNA virale riesce potentemente ad entrare nel batterio S.

Succede qualcosa post: entrare del materiale virale? Per capire usiamo gli enzimi di restrizione.

1. Entra genoma virale (Radioattivo)
2. Non individua dei geni
3. Elettroforesi dei frammenti del genoma batterico e distingue dal batterio perché radioattivi

• Solo nel ceppo B
• Solo nel ceppo S; bande con pesi molecolari differenti, ma una rimane tagliata a caso dove mostra specificità

Enzimi di restrizione: specie di forbici

Le sequenze tagliate dagli enzimi sono simmetriche e sono dette palindromiche.

• Eco RI
• Eco RV
• Pst I

Eco RI: riconosce sequenze quadrimedali, 6 basi e taglia in modo asimmetrico.

GAATTC: viene tagliata dall'enzima EcoRI.

Pst I: taglia tra G e A, tra gli stessi nucleotidi, un modo simile a Eco RI, ma l'estremità visibile è 3'.

• 3' protruding

Eco RV: taglia in mezzo e genera estremità franche - blunt.

• 5' protruding

Taglio avviene solo se tutti i nucleotidi sono giusti.

Enzimi che hanno specificità assoluta per le sequenze che riconoscono e tagliano.

Come fa il batterio a proteggere il proprio?

Batterio non contiene la sequenza di riconoscimento degli enzimi.

Non è vero e pieno di queste sequenze GAATTC.

• Enzimi proteggono le sequenze di riconoscimento con un meccanismo metiltransferasi.

Metilasi: enzimi che agiscono sulle stesse sequenze degli enzimi di restrizione, ma mettono le basi in modo che queste non vengano riconosciute nelle nostre cellule.

Nei batteri vengono riconosciute.

Si fa grazie all'ibridazione: funzione da riconoscimento molecolare specifico

• Una viriotta purificata ci permette di avere delle sequenze specifiche che possono essere usate come campioni di DNA con la loro sequenza complementare.
• La cosa difficile è vedere se l'ibridazione è avvenuta oppure no.

Come?

• Dopo l'ibridazione, si lava per separare capi legati e sonda: bisogna dividerli in due fasi diverse: una liquida, una solida.
• Metodo elettroforico per separare le molecole in base alla loro dimensione; cosi non si muovono nel flusso.

Si può catturare un DNA marcato da altre sequenze da purificare, non per forza che va visto.

• DNA a doppio filamento -> denaturazione -> stampo + prolunga con DNA e polimerasi anche legando i radioisotopi.
• Se ho un primer segnalo con etanolo.

Ibridazione su membrana (Dot Blot)

1. Attacco del DNA a un estratto dai tessuti al foglietto per microfiltrazione.
2. Saturazione.
3. Target e sonda, si fa ibridazione e si separano con legami covalenti specifici.
4. Evidenziare la sonda.

L'ibridazione avviene tra queste due.

Target: molecola da evidenziare

Sonda: molecola che abbiamo marcato

• Target=sonda, anche se non era stato specificato lo abbiamo messo nella sonda tu
• Sciolto via sonda=distribuire legami dedicati specifici
• Evidenziare la sonda con lastra/lettura di fluorescenza, dipende dal tracciato utilizzato.

Due la membrana è il metodo basato su ibridazione preselettiva se è virus o non ibridata la DNA.

• Se di solito si tratta, viene inserito o se hai l'analisi duale.
• Aumentato il segnale è più viral, è salo più totale, da visualizzare.
• Alla inviorazione e muovono, aumento e il segnale è minore e si sa l'analisi virale salo più tot, andiamo a individuare.

Come si stabilisce chi è positivo e chi negativo?

• Bisogna avere un riferimento di quantità di un soggetto che sicuramente non è infetto per dare il controllo negativo.

Come possiamo capire se il virus è in forma attiva o inattiva?

• Disegno guardo che le molecole di mRNA trascritte, li isolando ed estraendo dagli linfociti.

RNA si ripo alla membrana, ibridazione.

Ci sono tecniche molto più sensibili, che prevedono l'elettroforesi prima dell'ibridazione, e separo la DNA con la.

Southern Blot:

• Target=DNA (plasmidi o cromosomi, come le assene nel gel), anche target di DNA polimerasi per sequenza terminazioni.

Plasmide impopolazione clonale e digestione con enzimi di restrizione (n. presenza dipende da quanti siti ci sono). Tagliando con Eco ci ritroviamo 2 bande base, sul cotone video, flora normale aumentata ad ognuna si muove nel flusso.

Se faccio eco dì, prodotti che ho prodotti derivati della digestione.

Se qui inserisce segno ponte, dove studio una topologia lineare di mitote, comple e cuore per banda unica.

10

Per ogni ciclo di replicazione produciamo

cinètica medcica lunga

cinètica lineare +

medcica lunga

è necessario marcare

perchè l'amplificazione farà

che se fossece una sottrazione il

numero di ciclio dovrò la corsa

Cinetica esponenziale messo utile ha

piattaforma: tecniche a altre fasis positive*

Per cui avendo tempie a due

avendo sappiamo: dove sono santugiano

verso il vabbrioir raddoppio

Più su con una

Pirolatoina

aggiungendo mucicantile

aggiunto metilato,

mucifugno stato factor

cinètica medcica corte: (gioco all'addoppio)

esporenziale

dopo 30 ciclio: 60 molecole lunghe +

2^o medcico corte

il test viene piubetto con

orsa betipropetica

su gel di agaroso

A causa delicateigata sensibilità della PCR:

anche una medcica causale puòssenza simplificata

--> nell'attente 'tutti 4 ampliphi

contaminazione

plateau

2n RCR con ampliphi

per chiunque dopie

avpione 1 - multiplic copia

nell'area stibaluata

prepare to complice:

taxiogeneico sistema

produce i neoleicida

Postche'

finisco i muociti

pica fevere end fotocila poet

essa dell'rimposta gente

quascor est : vive una floroscenza

chiusa la piritari del sopresso

Real Time PCR : Amplific'azione in tempo reale -

metodo mojice x scopire quate nuove molecole

verghe.');