Appunti di Biologia Molecolare

PABP

(poli A binding protein), che ne

permettono il suo

mascheramento.

Si parla di 200 nucleotidi perché

la coda poliA va a chiudersi su

sé stessa, formando un nodo di

quella lunghezza.

Splicing

L’RNA trascritto in realtà è un premRNA che dovrà subire una serie di

modifiche per la maturazione.

i geni negli eucarioti contengono porzioni codificanti (esoni) e porzioni

non codificanti (introni). Questo concetto, però, non riguarda soltanto

gli eucarioti: in misura minore si trovano anche introni in batteri e

virus.

La scoperta dei geni “interrotti” risale al ’77 ed è stata fatta

ottimizzando le condizioni dei reagenti formando degli ibridi RNADNA

(r-loop). Facendo questi ibridi si osserva che si ha solo una

parziale sovrapposizione tra le parti mentre che sono delle anse che

rimangono fuori (introni).

La conoscenza attuale ci dice che le cose cambiano da specie a specie ma in genere si vede che la

maggior parte dei geni sono interrotti. Gli esoni sono rappresentanti con parallelepipedi più spesso e

gli introni sono delle linee. Il processo di maturazione vede il taglio degli introni e il riattaccamento

degli esoni (splicing: taglio degli introni e ricucitura esone-esone).

Nel corso dell’evoluzione l’importanza degli introni è sempre stata maggiore in quanto sono

fondamentali per il trascritto perché consentono la corretta maturazione e hanno ripercussioni su

maturazione di premRNA, trasporto, controllo di bozze ed efficienza.

La presenza di introni, inoltre, è un’opportunità di avere isoforme dei geni (splicing alternativo).

Un’ulteriore ragione evolutiva degli introni è quella che li vede come elementi mobili fondamentali

per la creazione di nuovi geni.

Nel gene ci sono meccanismi di

lettura per far si che il macchinario

che catalizza la reazione di splicing

possa agire correttamente. Un

minimo shift di lettura può causare

gravi conseguenze, quindi, è

necessario avere un meccanismo

controllato. Il meccanismo avviene

principalmente a carico dell’introne dove riconosciamo una serie di elementi:

• Sito donatore (splicing al 5’): GU è estremamente conservato ma non è sufficiente per il

riconoscimento, quindi, è fiancheggiato da altri nucleotidi con un certo livello di

conservazione. IMPO: i siti di splicing non sono tutti uguali, c’è motif che è conservato ma

variabile quindi ciò che da la forza di un sito di splicing è una sequenza consenso. Il sito di

splicing più si avvicina alla sequenza consenso più forte sarà. Questo è vero anche al 3’.

• Sito accettore (di splicing al 3’): AG+sequenza molto conservata con tratto ricco di

pirimidine (elemento di lettura).

• Branching point: è sempre presente una A che si trova all’interno di un motif ricorrente

Questi tre elementi sono elementi in cis

che vengono riconosciuti dal macchinario

di splicing che è lo splicesosoma che deve

fare due reazioni di trans-esterificazione.

Parte tutto dall’A nel branching point che

fa un attacco nucleofilo con il suo gruppo

ossidrile al gruppo fosfato di GU al 5’.

Si viene a creare un lazzo e l’A viene

coinvolta in un triplice legame

fosfodiesterico.

Nell’esone che si trova a monte a questo

punto si è liberato un 3’OH che è in grado

di fare un attacco nucleofilo all’AG.

Si ha un legame fosfodiesterico tra l’esone

che si trova a valle e quello a monte che

viene ora linearizzato.

Dal punto di vista energetico è a bilancio energetico nullo ma consuma energia utilizzata per portare

le parti nel sito catalitico e a fare questo è lo splicesosoma. L’ATP serve a garantire il corretto

assemblamento dello splicesosoma.

Lo splicesoma è costituito da 5 RNA e 200 proteine che si assemblano un una seria di fattori. Questi

fattori sono costituiti da un RNA e un set di proteina. L’RNA è uno smaller nuclear RNA che si

associa con un certo numero di proteine per formare un complesso ribonucleoproteico che si chiama

SNURP (smaller nuclear ribonuclear protein particle).

La parte proteica è formata da 7 proteine comuni (SM), le altre sono accessorie quindi ogni fattori

avrà le proprie.

Lo splicesosoma:

• È un complesso dinamico: la sua composizione durante le reazioni non è sempre la stessa:

1. Il primo a entrare è il fattore U1 che è un lettore della sequenza. A leggere la sequenza è

la parte a RNA

2. Interviene la branch point binding protein che recluta l’U2 ausiliary factor costituito da

una subunità 65 lettrice del tratto di

polipirimidine mentre l’altra legge

l’inizio della parte al 3’

3. Interviene un trimero di fattori

U4,U5 e U6. U4 e U6 hanno

interazioni proteina-proteina che

stabilizzano l’interazione. U4

interagisce con U2 e U6 con U1.

4. C’è una giustapposizione dei

componenti (fondamentale perché

le trans-esterificazioni avvengano)

5. Il complesso prende il nome di

complesso B1

6. U6 scalza U1 che viene eliminato

grazie a prp8 che è una subunità di

U5 che facilità questo processo.

7. Viene eliminato U4

8. Il complesso si chiama ora B2

9. Rimpiazzando U1 da U6, U6

interagisce con U2 che ora è vicino

10. Questo porta la A del branching

point nel sito catalitico

11. Passiamo al complesso C1 che è

propedeutico all’attacco del gruppo

fosfato alla G completando la

seconda reazione di trans-ester

Un meccanismo ben caratterizzato è quello dell’autosplicing cioè introni che sono in grado di

effettuare splicing senza ricorrere a elementi in trans. Questi elementi funzionano da ribozine e sono

• Classe 1: introni di lunghezza tipica tra 250-300 nucleotidi costituita da una serie di loop

structures. I loop conservati sono 9. Ci può essere una certa variabilità e quello che si

osserva è che l’organizzazione in questo sistema di anse divide la struttura in una superiore e

una inferiore. La reazione di autosplicing, in questo caso, richiede un intervento dall’esterno

cioè una guanina fornita dall’esterno. È proprio la exo-G che media l’attacco nucleofilo del

suo 3’ al 5’ fosfato del sito di splicing.

• Classe 2: la reazione è molto simile a quella dello splicesonoma. Questi introni sono dai 500

ai 1000 nucleotidi organizzati in una struttura a raggera con 6 domini di cui il D1 è quello

più grande. In questo caso non serve il ricorso di un nucleotide esogeno ma è la A del

branching point che effettua l’attacco nucleofilo al sito di splicing al 5’. Questa seconda

classe è molto simile nel funzionamento a quello dello splicesosoma e per questo di pensa

che esso si sia evoluto da questi elementi di classe 2.

Questi introni in realtà al loro interno nascondono delle orf che generalmente si trovano nel motivo

ad ansa per non interagire con il resto della struttura.

In vivo, affinchè questo processo sia efficace intervengono delle proteine che non agiscono con

azione catalitiche ma agiscono da chaperonine. Le orf nascoste negli introni codificano per le

chaperonine, proteine che negli introni di classe 1 funzionano anche da endonucleasi mentre in

quelli di tipo 2 funzionano da trascrittasi inverse. La presenza di queste garantisce la funzione di

elementi mobili degli introni.

Lo splicing trattato finora è costitutivo cioè gli esoni sono trascritti nell’ordine in cui appaiono.

In realtà può verificarsi anche lo splicing alternativo in cui può crearsi un’isoforma diversa che

porta anche a una proteina diversa da quella che si avrebbe normalmente.

Questo è un fattore fondamentale per generare isoforme con funzioni diverse.

Lo splicing alternativo però non è l’unico modo di ottenere proteine diverse dallo stesso gene, un

esempio può essere la presenza di diversi siti di poliadenilazione che possono portare a siti di

attacco diversi.

Splicing alternativo

Non tutti i siti di splicing sono

uguali (forti o deboli in base a

quanto sono vicini alla sequenza

consenso).

Ci sono elementi in cis che

funzionano da enhancer e silencer

dello splicing. Questi enhancer e silencer si possono trovare sia su introni che su esoni. ISE sta per

intronic splicing enhancer, poi abbiamo ESS, ESE e ISS.

Gli elementi in trans che funzionano da modulatori positivi sono di solito delle proteine della

famiglia SR che aiutano a raggiungere più facilmente il far si che lo splicesosoma si assembli.

Gli elementi in trans che inibiscono lo splicing sono silencer intronici cioè elementi che legano il

silencer, generalmente si legano al tratto di polipirimidine quindi i fattori di cui abbiamo parlato non

riescono a leggere il branching point e per ingombro sterico inibiscono la formazione dello

splicesosoma.

Editing

Le basi modificate non sono incorporate dalla polimerasi, questa incorpora le basi canoniche che

poi sono soggette a editing che poi va a creare la base modificata. A fronte di poche modifiche

caratterizzate dal DNA, nell’RNA ci sono molte più modifiche.

Il vantaggio dell’editing è generalmente che queste basi editate sono riconosciute come basi diverse

dal macchinario cellulare quindi editarle vuol dire fare una conversione di base potenziando le

capacità del genoma (uscendo dai limiti delle 4 basi).

Un tipico esempio è l’editing da citosina-uracile che avviene da OBE a carico del gene per l’ApoB.

Non tutte le C, chiaramente, saranno soggette a editing ma saranno solo quelle in posizioni

specifiche.

Questo macchinario di editing che si chiama editosoma deve fare due cose: avere un meccanismo di

riconoscimento e lettura e avere un meccanismo di editing.

Nel gene della proteina ApoB

nell’esone 26 ci porta alla

conversione di CAA a UAA.

L’isoforma non editata forma una

proteina allungata preferita nel

fegato, quella editata è preferita

nell’intestino.

Questo accade perché lo scrittore

sarà solo nell’intestino quindi il gene

editato sarà solo lì e si può avere

tessuto specificità.

Un altro esempio è la conversione da adenosina a

inosina a carico di proteine ADAR che hanno come

motivo catalitico una adenosina aminasi.

Si possono formare delle eliche intramolecolari a

livello, ad esempio, delle sequenza ALU. Se si forma

un elica allora la proteina ADAR può leggere,

riconoscere e apporre la modifica. Qui ci sono due

casi di cui il primo è il recettore del glutammato che a

livello di intr