Appunti di Biologia molecolare

RM

polimerasi resta bloccata nel complesso chiuso. Si forma un complesso binario RNA polimerasi-promotore

P e la polimerasi non riesce ad iniziare la trascrizione. Per iniziare la trascrizione, necessita dell’intervento

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di CI, il repressore di lambda che si autocontrolla). Se viene espressa N si esprimono i geni precoci ritardati

a partire da CIII e CII uno verso sinistra e l’altro verso destra, e si comincia a produrre CI. Se CI viene

prodotto, può formare un dimero che si associa agli operatori O e O . Se lega, come due dimeri, su

R L

entrambi gli operatori, si innesca un ciclo di equilibrio in cui la quantità di repressore fornito è tale da

assicura in ogni istante che questi siti siano occupati. Questo repressore ha alta affinità con il DNA e ha un

meccanismo di legame che è operativo. Il monomero è il repressore e ha capacità di dimerizzare, ha un

dominio di dimerizzazione e un dominio di legame al DNA. Il dimero del repressore lega un sito

sull’operatore che è associato al promotore e, con un legame cooperativo, si lega. La polimerasi non è più n

grado di legare i promotori.

Questo meccanismo spegne tutta la cascata dei geni del genoma fagico. Se non parte la trascrizione da P e

L

da P , nessun altro gene sarà espresso. Il P , anche se viene utilizzato per produrre il piccolo RNA di 194

R R’

basi, in assenza di Q non saranno espressi i geni per la lisi. Nel frattempo è avvenuto un evento di

ricombinazione e il genoma è stato integrato in quello batterico.

Questa regione di controllo conferisce immunità.

COS’E’ L’IMMUNITA’? Il fago riconosce la cellula ospite attraverso il meccanismo di riconoscimento di

proteine localizzate sulla membrana esterna del batterio. Quando c’è il recettore del fago sulla cellula

ospite, il fago ci si attacca e entra il DNA all’interno della cellula. Questo determina, nella cellula ospite, un

meccanismo di immunità contro le infezioni dei fagi della stessa famiglia, cioè che utilizzano la stessa via di

infezione, lo stesso recettore.

Lambda è nel ciclo lisogenico, CI è prodotto. Se entra un altro genoma lambda e CI è già espresso e blocca

l’ingresso della polimerasi su P e P del nuovo fago che è entrato, il DNA che è appena entrato non sarà mai

L R

espresso e andrà incontro a degradazione.

Il meccanismo di immunità è determinato dalla presenza di lambda. Un mutante in CI (che non produce CI)

proverà ad entrare in lisogenia ma andrà solo e soltanto nella cascata litica. Un mutante di CI prende il

lambda virulento.

Gli operatori, se mutati, non sono riconosciuti specificamente e con efficienza da CI, CI si lega male e il fago

entra nel ciclo litico.

Ci sono mutanti virulenti che sono resistenti alla lisogenia. Non risentono dell’immunità.

Se infetto una cellula lisogena con un mutante nell’operatore, il repressore non potrà legare l’operatore,

quindi la polimerasi ci si lega ed esprimerà i geni precoci ritardati e i geni tardivi.

CI, CII, CIII sono mutazioni che rendono il ciclo di lambda particolare.

ESEMPIO: piastra con agar sulla quale è cresciuto Coli infettato con lambda. C’è un eccesso di

batteri e una carenza di fagi in modo da avere, dopo una notte passata a 37°C, un’immagine con un

tappetino di batteri che rendono la piastra opaca (colorino verdastro) con dei puntini in trasparenza

→ placche create per infezioni fagiche delle cellule. Cellula infettata dal fago lambda che è entrata

in ciclo litico, ha prodotto centinaia di fagi che hanno prodotto e integrato le cellule infettate. Si

vedono due morfologie: una chiara e una torbida.

Coroncina trasparente con una piccola colonia di batteri resistenti, hanno immunità.

Tutti i virus che produce una cellula sono capaci di infettare un batterio. Il risultato sarà che

ciascuna cellula batterica sarebbe stata lisata.

In questo caso non avviene questo. Una cellula infettata va in lisogenia, una cellula infettata va in

ciclo litico. Quella che va in lisogenia diventa resistente a infezione fagica per il fenomeno

dell’immunità. Per diventare lisogeno deve integrare il genoma fagico in quello batterico.

Anche gli altri due geni CII e CIII, sono stati identificati in questo modo: non hanno la capacità di

entrare in lisogenia.

RIPASSO

Fago lambda e la sua vita complicata nel decidere cosa fare quando infetta una cellula di Coli: intraprendere

ciclo litico o lisogenico?

Abbiamo visto che le due vie sono interconnesse: la parte iniziale dell’espressione è identica sia per la via di

infezione litica che per la via lisogenica.

FIGURA 14.8

Abbiamo parlato della mappa genetica di questo fago che viene impacchettato nel capside. Abbiamo una

doppia elica lineare con delle estremità coesive. L’ordine dei geni è quello indicato nella figura, c’è una

regione di regolazione che codifica per il regolatore trascrizionale di lambda (repressore di lambda, rho) e

dei promotori che sono riconosciuti dalla polimerasi dell’ospite nella fase di infezione. Il DNA è lineare ma

ha delle estremità coesive che si attaccano per appaiamento di basi complementari. Si crea una molecola

circolare che viene utilizzata per la trascrizione.

I primi promotori ad essere trascritti sono P , P , e P . P va verso sinistra e trascrive il gene N, P va verso

L R R’ L R

destra e trascrive il gene CRO. N è un anti-terminatore che permette l’anti-terminazione per trascrivere i

geni a valle di N e di CRO. A sinistra troviamo i geni coinvolti nella ricombinazione e a destra quelli coinvolti

nella replicazione. I primi due geni espressi sono definiti geni precoci immediati, i geni di replicazione e

ricombinazione sono geni precoci ritardati. All’interno dei geni della replicazione c’è il gene Q che serve ad

anti-terminare il trascritto che inizia su P , è un trascritto di 194 basi. P è un promotore localizzato tra i

R’ R’

geni Q ed S. Q codifica per l’anti-terminatore di questo trascritto P per codificare i geni che causano la lisi

R’

della cellula.

La cascata litica è molto lineare. Parlando della lisogenia, siamo partiti dall’analizzare la regione di controllo,

quindi la regione di regolazione che deve associare ad N e CRO, oltre al promotore, anche gli operatori.

→

P /O e P /O gli operatori si sovrappongono ai promotori per il controllo dei geni precoci immediati e

L L R R

ritardati.

Tra i promotori P e P troviamo il gene di CI, repressore di lambda che, una volta che avviene l’integrazione

L R

del fago lambda nel cromosoma batterico, è responsabile del mantenimento della lisogenia.

FIGURA 14.12

Il repressore di lambda è una proteina piccola capace di dimerizzare. Il dimero riconosce gli operatori

associati ai promotori sia di destra che di sinistra. Il legame di un dimero stimola il legame di un altro

dimero attraverso il meccanismo cooperativo di interazione di queste forme dimeriche di repressore.

Siccome O è sovrapposto a P ed è legato a due dimeri consecutivi del repressore lambda, la trascrizione

R R

da P è bloccata. Stesso fenomeno succede sull’operatore di sinistra, viene bloccato il promotore di sinistra.

R

Viene bloccata la trascrizione verso sinistra (ricombinazione) e verso destra (replicazione).

Questa regione conferisce immunità contro infezione di fagi della stessa classe, ossia fagi che hanno una

regione di controllo simile a quella di lambda. Il meccanismo con cui si conferisce immunità è abbastanza

intuitivo. Se arresto il ciclo lisogeno, ho un batterio che sta producendo il repressore che lega gli operatori.

In seguito all’infezione di un altro fago lambda, il repressore già espresso occupa gli operatori del nuovo

genoma e blocca l’entrata della polimerasi sui promotori P e P del nuovo genoma. La polimerasi non può

L R

legarsi e non può innescare il ciclo litico e l’espressione. Il fago va incontro a degradazione del DNA. Questo

si può fare con lambda wt o con lambda che ha gli stessi operatori e lo stesso repressore.

Ci sono delle eccezioni a questa immunità: i mutanti negli operatori O e O di un fago infettante è

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resistente. Se è mutato l’operatore del fago infettante in lisogeno, il repressore non potrà legare gli

operatori. Il fago, quasi sicuramente, andrà nel ciclo litico. Questi mutanti sono detti LAMBDA VIR: fagi

lambda iper-virulenti.

Induzione permette a tutto il genoma di lambda integrato nel cromosoma di Coli, di essere propagato da

una generazione alle successive come se fosse un gene di Coli. Un meccanismo di repressione continua,

costante ed efficiente dei geni che fanno parte del genoma integrato del fago.

L’induzione va avanti finché l’equilibrio non viene disturbato. Questo è un controllo autogeno in quanto il

repressore lega gli operatori associati al promotore e reprime la trascrizione a sinistra e a destra, ma il

secondo dimero legato è responsabile del promotore P .

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P è un promotore che viene riconosciuto dalla polimerasi di Coli, ma la reazione di riconoscimento non va

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oltre il complesso binario chiuso. C’è il legame della polimerasi al promotore ma manca la transizione da

complesso chiuso a complesso aperto e quindi alla fase di allungamento. Il repressore su questo operatore

ha il compito di attivare l’RNA polimerasi stimolando la transizione da complesso chiuso a complesso

aperto, quindi favorendo la creazione di RNA e l’espressione di CI.

CI ha due ruoli:

1. Reprimere. Come repressore, reprime la trascrizione di tutti i geni del fago tranne uno.

2. Su questo gene speciale funziona in modo positivo, funge da attivatore trascrizionale per produrre

la quantità adeguata di repressore per assicurare che gli operatori di destra e di sinistra siano

spenti. Spegne l’espressione di tutti i geni.

L’induzione non consiste in un cambiamento allosterico della proteina, ma in una degradazione. Quando si

va incontro allo stress, vengono attivate delle proteasi. Una di queste proteasi è responsabile del taglio del

repressore. Si rompe l’equilibrio di produrre la giusta quantità di repressore in grado di occupare gli

operatori. Se interrompiamo questo equilibrio, la reazione va verso la dissociazione dei repressori dagli

operatori. La polimerasi di Coli, a questo punto, subito riconosce i promotori e comincia a trascrivere verso

sinistra, verso destra, produce l’anti-terminatore, esprime i geni precoci ritardati, si scinde dal genoma di

Coli e può intraprendere il ciclo litico.

FENOMENO DELL’INDUZIONE: se i dimeri del repressore non sono più in grado di tenere costanteme