Appunti di Biologia molecolare sul clonaggio molecolare

Clonaggio Molecolare

È una delle applicazioni degli enzimi di restrizione e consiste nel:

eliminare un frammento di DNA desiderato all'interno di un opportuno vettore molecolare

Il vettore molecolare è rappresentato da un plasmide

pBR322 → uno dei primi plasmidi ad essere stato isolato e manipolato da ricercatori.

• Rappresenta un prototipo da cui sono stati derivati numerosi altri plasmidi utilizzati in tecniche di clonaggio molecolare.
• È un plasmide molto semplice di circa 4360 paia di basi (facile da manipolare).
• contiene un sito OriC che rappresenta l'origine di replicazione del plasmide

Clonaggio Molecolare

È una delle applicazioni degli enzimi di restrizione e consiste nel:

clonare un frammento di DNA desiderato all'interno di un opportuno vettore molecolare

Il vettore molecolare è rappresentato di un PLASMIDE

pBR322 → uno dei primi plasmidi ad essere stato isolato e manipolato dai ricercatori.

• Rappresenta un prototipo da cui sono stati derivati numerosi altri plasmidi utilizzati in tecniche di clonaggio molecolare.
• È un plasmide molto semplice di circa 4360 paia di basi (facile da manipolare).
• Contiene un sito OriC che rappresenta l'origine di replicazione del plasmide.

Grazie a questo sito il plasmide può replicarsi in modo autonomo nella cellula batterica. Quindi all'interno della cellula batterica saranno presenti più copie del plasmide.

• All'interno del plasmide si distinguono 2 geni orientati in senso opposto (su filamenti opposti)
• Amp^r -> conferisce al batterio la resistenza all'antibiotico AMPICILLINA
• Tet^r -> codifica per una proteina che conferisce al batterio, resistenza all'antibiotico TETRACICLINA
• Il plasmide contiene diversi siti di restrizione, che permettono a enzimi di restrizione (EcoRI, BamHI...) di effettuare dei tagli per inserire frammenti di DNA di interesse.

Clonaggio molecolare con pBR322

1. Si prende un frammento di DNA estraneo e lo si taglia con enzima di restrizione BamHI in modo da ottenere una serie di frammenti di DNA.

   Uno di questi frammenti sarà quello da clonare.

2. Con lo stesso enzima di restrizione BamHI si taglia il plasmide pBR322.

   Il sito di restrizione di BamHI si trova in corrispondenza del gene Tet^R, quindi il taglio sarà all'interno del gene.

   • Si deve utilizzare lo stesso enzima di restrizione per tagliare il plasmide in modo che si ottengano estremità complementari e possano legare tra loro facilmente.

3. Quando il plasmide viene tagliato si linearizza, PLASMIDE LINEARIZZATO

   Questo viene incubato assieme al frammento di DNA in modo che il frammento possa inserirsi nel plasmide.

   Tra le estremità appaiate si forma un'interazione.

debole, rappresentata da legami a idrogeno

da struttura deve essere resa più stabile attraverso la formazione di legami fosfodiesterici. Questo processo è chiamato LIGAZIONE e l'enzima che lo catalizza è la DNA LIGASI.

Quando il frammento di DNA si inserisce nel plasmide linearezzato, si forma il PLASMIDE RICOMBINATO o COSTRUTTO. Tuttavia, può anche accadere che il plasmide linearezzato si richiuda su se stesso, formando il PLASMIDE RICICLARIZZATO.

Terminata la reazione di ligazione si effettua la TRASFORMAZIONE DEI BATTERI (E. coli in questo caso). La trasformazione prevede l'incubazione di una preparazione di cellule batteriche COMPETENTI, insieme al ligato

batteri capaci di acquisire frammenti di DNA dall'ambiente circostante

Al termine della trasformazione si avranno

• cellule che non hanno acquisito plasmidi
• cellule che hanno acquisito plasmidi ricombinanti
• cellule che hanno acquisito il plasmide ricircolarizzato

Quando all'interno del plasmide è stato inserito il frammento di DNA all'interno del gene Tet^R questo è stato inattivato perchè la sua sequenza originale è stata interrotta → INATTIVAZIONE INSERZIONALE DEL GENE

Su questo si basa il clonaggio

Nel plasmide ricircolarizzato, il gene Tet^R non è ricostituito, riformando la sua struttura originale

(6) Si iniziano a fare delle selezioni con l'obiettivo di distinguere le popolazioni di batteri per selezionare i batteri contenenti il plasmide ricombinante

La prima selezione permette di eliminare tutti quei batteri che non si sono trasformati.

Si seminano i batteri su una piastra contenente un terreno di crescita con ampicillina.

In queste condizioni i batteri che non contengono plasmidi non riescono a crescere in quanto non contengono alcuna forma di gene che possa codificare per le proteine che contrastano l'ampicillina.

La seconda selezione permette di distinguere le 2 popo