Appunti di Biologia Molecolare

Basi azotate e nucleotidi

Basi azotate

Le basi azotate sono suddivise in pirimidine e in purine. Le pirimidine sono tre e sono formate da un anello pirimidinico (un eterociclo con 2 atomi di azoto). Sono la citosina, la timina e l'uracile. La numerazione parte dall’azoto in basso e prosegue in senso orario. Quindi in base alla numerazione avremo:

• Citosina: 2-ossi 4-amminopirimidina
• Timina: 2,4-diossi 5-metilpirimidina
• Uracile: 2,4-diossipirimidina

La citosina e la timina sono presenti solo nel DNA, mentre nell’RNA avremo l’uracile al posto della timina.

Le purine sono due e sono formate da un anello pirimidinico fuso con una molecola chiamata imidazolo. Sono l'adenina e la guanina. Per quanto riguarda la numerazione, questa parte dall’azoto posto in alto a sinistra e va in senso antiorario. Quindi in base alla numerazione avremo:

• Adenina: 6-amminopurina
• Guanina: 2-ammino 6-ossipurina

Sia l’adenina che la guanina sono presenti sia nel DNA che nell’RNA.

Nucleosidi e nucleotidi

Per ogni base azotata esiste un corrispondente nucleoside, formato da una base azotata (purinica o pirimidinica) legata ad uno zucchero. Ed è qui che abbiamo la differenza tra DNA ed RNA. Lo zucchero è il ribosio, e la sua configurazione è un anomero β. Se leghiamo la posizione 1 del ribosio con la posizione 1 di una pirimidina, viene eliminata una molecola d’acqua e si ottengono i nucleosidi corrispondenti. I nucleosidi si riconoscono dalla loro desinenza in –ina. Nell’RNA avremo:

• Uracile + ribosio = uridina
• Citosina + ribosio = citidina
• Adenina + ribosio = adenosina
• Guanina + ribosio = guanosina

Nel DNA avremo:

• Citosina + deossiribosio = deossicitidina
• Timina + deossiribosio = deossitimidina o timidina
• Adenina + deossiribosio = deossiadenosina
• Guanina + deossiribosio = deossiguanosina

Poi esistono i nucleotidi che si formano quando un gruppo fosfato si lega ad un nucleoside e precisamente si lega allo zucchero nella posizione 5’. La base di un nucleotide si lega all’atomo di carbonio 1’ dello zucchero con un legame N-β-glicosilico. Il gruppo fosforico è invece esterificato sull’atomo di carbonio 5’. Il legame N-β-glicosilico si forma attraverso la rimozione di una molecola di acqua.

Nucleotidi del DNA e dell'RNA

Legame fosfodiestere e legami idrogeno

Se prendiamo in considerazione la singola elica dell’RNA, o una delle due eliche del DNA, possiamo notare che tra un nucleotide e l’altro si instaurano legami fosfodiestere 5’ → 3’, tra il fosforo in C5 di un nucleotide e il gruppo OH in posizione C3 del ribosio. Per rompere questo legame è necessaria molta energia. Ricordiamo che un legame estere sussiste tra un gruppo alcolico ed un gruppo acido. Un legame fosfodiestere sussiste tra un gruppo acido che si lega contemporaneamente a due gruppi alcolici.

Nella doppia elica del DNA le basi azotate si uniscono tra loro tramite legami idrogeno che si instaurano tra le basi di un’elica e l’altra. Abbiamo legami di un’elica che va dalle posizioni 5’ alle posizioni 3’ (dal basso verso l’alto), e l’altra elica antiparallela che va dalla posizione 5’ alla posizione 3’ (dall’alto verso il basso). Quindi, quello che tiene unita la doppia elica del DNA sono i legami idrogeno che si stabilizzano tra le basi azotate. Sono legami deboli, ma se ne prendiamo 1000 diventano legami molto forti. Le basi azotate si accoppiano secondo l’appaiamento di Watson e Crick.

• DNA: Adenina – Timina (A-T), Guanina – Citosina (G-C)
• RNA: Adenina – Uracile (A-U), Guanina – Citosina (G-C)

Configurazione del DNA

Doppia elica descritta da Watson e Crick

Nel DNA le due eliche polinucleotidiche si avvolgono intorno ad un’asse comune formando una doppia elica. Le due catene vanno in direzioni opposte, ossia sono antiparallele (un’elica andrà da 3’ verso 5’ e l’altra da 5’ a 3’). Le due catene antiparallele formano una doppia elica destrorsa. Le basi occupano la parte interna dell’elica, mentre gli zuccheri alternati ai gruppi fosfato sono disposti all’esterno. La superficie della doppia elica contiene due scanalature (solchi con diversa profondità): scalanatura maggiore e scalanatura minore. Ogni base è legata mediante legami idrogeno con la base presente nella catena opposta (A-T C-G: appaiamento complementare delle basi).

Abbiamo tre tipi di DNA.

• DNA A: È ottenuto da quello B per disidratazione. Un giro d’elica è grande 2,46 nm in cui troviamo 11 coppie di basi. È quindi molto più compatto del DNA B. Ciò comporta la presenza di un solco maggiore stretto e profondo, mentre quello minore è superficiale e ampio.
• DNA B: È quello più stabile. I due solchi sono alternati tra loro a destra e a sinistra dell’elica. Un giro d’elica è grande 3,4 nm in cui troviamo 10,4 coppie di basi.
• DNA Z: Le eliche sono molto più allungate come una molla tirata. Un giro d’elica misura 4,56 nm in cui troviamo 12 coppie di basi. Ciò comporta che il solco maggiore è convesso, mentre quello minore si riduce ad una fessura profonda.

Basi azotate in configurazione anti e sin

Le basi azotate possono trovarsi in due configurazioni:

• Anti: quando la base ruota rispetto allo zucchero e quindi si allontana da esso, riducendo al minimo le possibili interazioni ioniche e le forze di Van der Waals, e quindi sono più stabili.
• Sin: La base ruota rispetto allo zucchero e si avvicina ad esso; le interazioni sono quindi notevoli, e le basi, secondo le cariche, tendono ad allontanarsi e a respingersi.

Nel DNA Z le purine sono in conformazione sin e le pirimidine in anti. Nei DNA A e B le purine e le pirimidine sono tutte in anti.

DNA satellite

Nel DNA si trovano sequenza molto ripetitive chiamate DNA satellite, presente nel centromero e nei telomeri. Sono sequenze uniche o ripetute poche volte presenti nei geni del DNA degli eucarioti. Interposte alle sequenze codificanti, si trovano sequenze di DNA che mancano di funzioni codificanti. Questo DNA viene chiamato DNA intergenico e rappresenta il 30% del DNA totale. Il DNA intergenico ha una composizione di basi atipica, che si ripetono, che permette la loro distinzione dal resto del DNA. La porzione di DNA che codifica per le proteine sono gli esoni, quelle che non codifica per le proteine sono gli introni.

Nel DNA possiamo trovare sequenze di basi ripetute, intersperse (ripetute in maniera casuale) o ripetute in tandem (le unità ripetute sono una accanto all’altra). I frammenti di DNA con ripetizioni in tandem formano bande satelliti quando il DNA genomico viene frazionato mediante centrifugazione in gradiente di densità.

Il DNA satellite si divide in:

• Minisatellite: unità ripetuta lunga fino a 25 bp (si ripetono fino a 1000 volte).
• Microsatellite: unità ripetuta lunga da 2 a 5 bp (si ripetono fino a 100 volte).

Non esistono due persone con la stessa combinazione esatta di microsatelliti. Esaminando i microsatelliti possiamo ottenere un quadro ben preciso di un individuo, quindi determinare con esattezza di chi è quel DNA. È un utile strumento di indagine per i biologi molecolari (ad esempio in medicina forense).

DNA extracellulare

I procarioti non hanno nucleo, quindi il DNA è nel citoplasma. Gli eucarioti invece hanno il nucleo e quindi il DNA contenuto al suo interno; la duplicazione e la trascrizione avverrà nel nucleo e la sintesi delle proteine avverrà invece nel citoplasma.

Però, il DNA è contenuto anche in alcuni organelli delle cellule eucariotiche, ad esempio nei mitocondri (DNA mitocondriale), che contengono una piccola molecola di DNA circolare; nei cloroplasti (cellule vegetali) e nei batteri (plasmidi) che non fanno parte del corredo cromosomico dei batteri.

Organizzazione del DNA

Sequenze palindromiche

Nel DNA possiamo trovare alcune sequenze di DNA insolite. Le sequenze di basi che si ripetono nel DNA sono chiamate palindromi. Sono delle sequenze che possono essere lette da sinistra verso destra e viceversa. È la ripetizione delle stesse basi azotate, ma siccome il palindromo sta su due eliche diverse, abbiamo a che fare con un palindromo invertito. Oppure possiamo avere una zona palindromica nella stessa elica, allora abbiamo a che fare con un palindromo speculare.

Se abbiamo due zone complementari in una sola elica, separata da una zona non complementare, otteniamo una forcina. Se abbiamo un palindromo invertito, perché abbiamo una doppia elica, separate da una zona non complementare, avremo un’ansa cruciforme.

Superavvolgimento

Il DNA a doppia elica si duplica dando luogo a due cellule figlie che contengono lo stesso DNA. Un’elica sarà della cellula madre e l’altra verrà duplicata e sarà esattamente complementare. Ogni cellula figlia si porta appresso lo stesso corredo genetico della cellula madre. Nelle cellule il DNA è impacchettato. Ma come è possibile impacchettare tanto DNA in così poco spazio? L’impacchettamento avviene prendendo la doppia elica del DNA e avvolgendola su se stessa; in questo modo si forma una struttura sempre più compatta. Questo fenomeno di impacchettamento si chiama superavvolgimento.

L = T + W
L = numero di legame (quante volte un’elica tocca un’altra elica).
T = numero di giri di elica.
W = numero di supereliche (supereliche = superavvolgimenti).

Il numero di legami deve rimanere costante (L). Quindi visto che i superavvolgimenti comportano più legami, devo diminuire L, ossia il numero di legami presenti prima del superavvolgimento affinché questo sia lo stesso dopo il superavvolgimento. Quando si tenta di aprire l’elica in un punto si formano le supereliche positive. Per formare un superavvolgimento bisogna, quindi, svolgere la doppia elica e srotolare tanti giri quanti sono i superavvolgimenti che si vogliono creare affinché L rimanga costante. Quando il DNA è parzialmente srotolato e ha un superavvolgimento negativo, si dice che sono topologicamente equivalenti. Quindi il DNA denaturato di 25 volte e un DNA con 25 supereliche sono topologicamente equivalenti.

Il superavvolgimento può essere positivo o negativo; per distinguerli prendiamo un punto dell’elica e seguiamo l’andamento di una catena: se questa passa sopra l’altro filamento, è positiva; se passa sotto è negativa. Per compattare maggiormente il DNA, esso si avvolge anche intorno a delle proteine basiche dette istoni. Se proviamo ad avvolgere un DNA circolare intorno ad un istone, si formerà una struttura con una superelica positiva. Per rilassarlo bisognerà tagliarlo e formare una superelica negativa. I nucleosomi sono formati da vari istoni in cui è legato il DNA e formano una struttura chiamata solenoide con uno spessore di 30nm. Sei nucleosomi formano un solenoide.

Topoisomerasi

Quando un DNA si sta duplicando, la doppia elica è rigida. Esistono tanti legami idrogeno che tengono unite le due eliche. Aprendo le catene a monte e a valle aumentano i giri di elica: quindi si creano delle supereliche positive, che ad un certo punto bloccheranno la duplicazione del DNA e la trascrizione. Per evitare tutto questo intervengono due enzimi che si chiamano topoisomerasi che isomerizzano ed eliminano supereliche positive, creando supereliche negative. Questi enzimi tagliano il DNA, fanno passare l’elica dall’altra parte, e la ricongiungono. Le più conosciute sono la topoisomerasi I e la topoisomerasi II.

• Topoisomerasi I: creano delle interruzioni transitorie solo su un filamento del DNA. Si avvolgono intorno al DNA, tagliano un’elica e poi la rilegano. Non ha bisogno di ATP. Le topoisomerasi di tipo I si dividono a loro volta in IA e IB a seconda di come legano il fosfato, in posizione 5’ o in posizione 3’.
• Topoisomerasi II (chiamata anche girasi): taglia entrambi i filamenti di DNA ed introduce superavvolgimenti negativi, ovvero elimina superavvolgimenti positivi. Taglia le eliche del DNA e le tiene salde a se, altrimenti il DNA si perderebbe e si srotolerebbe. Scinde i filamenti opposti con 4 basi sfalsate, attacco covalente all’estremità 5’ del DNA attraverso un legame fosfotirosina e cambia il numero di legame di 2 unità, per la reazione richiedono magnesio e soprattutto ATP, perché in lei si viene a creare un cambiamento conformazionale tale da richiedere necessariamente energia.

Duplicazione del DNA nei procarioti

Nella duplicazione del DNA nei procarioti abbiamo un enzima chiamato DNA polimerasi III, che è quello che esegue tutto il processo di duplicazione della doppia elica di DNA. Essa aggiunge nucleotidi mediante legami fosfodiestere 5’ → 3’. La direzione di propagazione sul DNA è 3’ → 5’. La DNA polimerasi duplica sempre in direzione 3’ → 5’. Qui si crea un fenomeno per il quale, mentre un filamento 3’ → 5’ viene duplicato in maniera continua, l’altro filamento verrà duplicato in maniera discontinua proprio perché deve andare dal 3’ verso il 5’. Quindi, l’altro filamento viene duplicato a pezzi.

Inizio della duplicazione

La duplicazione del DNA avviene per mezzo della DNA polimerasi e inizia in un punto detto oriC (origine della duplicazione). L’oriC è formata da 245 coppie di basi. Le sequenze di importanza chiave sono due serie di brevi sequenze ripetute: tre sequenze di 13 coppie di basi e quattro sequenze con 9 coppie di basi. Si può notare che queste sequenze sono ricche di timine e adenine, che tra loro formano solo due legami idrogeno quindi sarà più facile aprire la catena del DNA.

Le quattro regioni dell’oriC sono delle zone che legano una proteina chiamata Dna A. Molte di queste proteine si legano in queste quattro zone attorcigliando il DNA. Poi si lega un’altra piccola molecola, chiamata HU che in presenza della tensione torsionale denatura la regione contenente le 3 sequenze ripetute di 13 bp, aprendo il DNA.

A questo punto il DNA si è aperto nell’oriC e intervengono immediatamente altre proteine, le elicasi, indicate anche come Dna B e Dna C. Esse devono svolgere la doppia elica del DNA. L’elicasi che viaggia sul filamento veloce si chiama proteina REP. Invece, l’elicasi che viaggia sul filamento lento è la DNA B. Immediatamente dopo, entrano in gioco altre proteine che si chiamano SSB, proteine che si legano al DNA singola elica, ed evitano che il DNA si riavvolga.

Man mano che le elicasi procedono, la Dna A che aveva indicato il segnale molecolare per l’apertura dell’oriC, pian piano si stacca. A questo punto interviene un’altra proteina chiamata primasi che sintetizza un corto frammento di RNA su stampo di DNA. Elicasi e primasi fanno parte di un complesso noto come primosoma. Il piccolo frammento di RNA sintetizzato dalla primasi si chiama RNA innesco, ovvero primer.

Ora arriva la DNA polimerasi III che si attacca al punto in cui si trova il primer di RNA legato al DNA e da quel punto inizia la duplicazione. La DNA polimerasi III può legarsi solo ad un doppio filamento, non può partire da un singolo filamento. In questo caso il doppio filamento è composto da un’elica di DNA e il primer di RNA. La DNA polimerasi III aggiunge nucleotidi secondo le complementarità delle basi.

È presente un primer di RNA su entrambe le eliche. Nel filamento 5’ → 3’ avremo tanti primer quanti sono i frammenti di Okazaki.

Il DNA degli eucarioti è lineare e abbiamo tante DNA polimerasi che partono da punti diversi. Le elicasi svolgono il DNA, lo aprono, e a valle il DNA si superavvolge mediante superavvolgimenti positivi. Man mano che la forcella di replicazione si sposta, il DNA assume una conformazione tesa, sempre più chiusa. Immediatamente davanti abbiamo le topoisomerasi che non appena si forma un superavvolgimento positivo, lo taglia, gira dall’altra parte e ne crea uno negativo in modo che la DNA polimerasi possa camminare tranquillamente.

Allungamento

I filamenti del DNA sono antiparalleli, quindi abbiamo un filamento 3’ → 5’ e l’altro filamento 5’ → 3’. La DNA polimerasi deve catalizzare la duplicazione di entrambi i filamenti, ovviamente con modalità diverse, perché non c’è DNA polimerasi capace di sintetizzare al contrario. Nella duplicazione del DNA si possono individuare due catene: catena veloce e catena lenta.

Se la DNA polimerasi III viaggia solo in direzione 3’ → 5’, come fa l’altra elica del DNA (che è antiparallela) ad essere duplicata? Okazaki, uno scienziato giapponese, ha risolto questo problema. Okazaki ha scoperto che quest’ultimo viene duplicato a pezzetti e successivamente viene saldato. Stiamo parlando dei famosi frammenti di Okazaki. Mentre nel filamento guida esiste solo un primer di RNA, nel filamento discontinuo esistono tanti primer di RNA quanti sono i frammenti di Okazaki. Come vengono formati i frammenti di Okazaki? La DNA polimerasi non può sintetizzare il DNA in maniera continua, ma lo sintetizza “tornando indietro”; in realtà non è l'enzima che si sposta, ma è il filamento copia che forma un cappio, rigirandosi e permettendo all'enz...