Appunti di Biologia molecolare

 PAUSE DELLA RNA POLIMERASI DURANTE L’ALLUNGAMENTO

Nonostante l’elevata processività della reazione enzimatica, la RNA polimerasi si ferma periodicamente

durante la sintesi. Questo fenomeno di pausa trascrizionale può essere dovuto a ostruzioni fisiche o

chimiche che hanno luogo nell’interazione tra DNA stampo e RNA appena sintetizzato, ed impediscono

all’enzima di muoversi agevolmente lungo il DNA.

Un esempio di impedimento fisico, che causa la pausa trascrizionale, si ha quando l’RNA trascritto presenta

delle piccole sequenze complementari che possono formare una forcina temporanea, le quali interagiscono

con l’RNA polimerasi bloccando transitoriamente la sintesi.

Oppure la pausa trascrizionale può essere causata anche dalla presenza di ibridi RNA-DNA che instaurano

legami deboli, per esempio in regioni ricche di AU o a causa dell’inserimento non corretto di una base.

La polimerasi, spesso, riesce da sola a far ripartire la sintesi, ma esistono delle proteine, dette fattori di

allungamento, che possono accelerare questo processo.

Talvolta si può verificare il fenomeno dell’arresto della trascrizione, quando l’enzima non riesce a

proseguire nella sintesi, senza l’intervento dei fattori di allungamento.

 SUPERAMENTO DELLA PAUSA E DELL’ARRESTO DELLA TRASCRIZIONE

Quando avviene una pausa durante la sintesi dell’RNA, il complesso di allungamento può arretrare lungo il

DNA. Questo arretramento causa la separazione di una porzione di RNA appena sintetizzato e la sua

protrusione dalla RNA polimerasi.

La RNA polimerasi può correggere eventuali errori di incorporazione attraverso due meccanismi:

 editing pirofosfolitico

 editing idrolitico

EDITING DELL’RNA: processo mediante il quale i ribonucleotidi presenti nell’RNA vengono modificati,

rimossi, o inseriti

Queste reazioni di editing espongono un nuova estremità 3’OH dell’RNA all’interno del sito attivo

dell’enzima, così che può continuare l’aggiunta di ribonucleotidi.

EDITING IDROLITICO

Intervengono delle proteine dette fattori di taglio del trascritto, le quali si legano alla RNA polimerasi

stimolandone l’attività endonucleasica intrinseca: la RNA polimerasi può catalizzare sia l’aggiunta dei

nucleotidi, sia il taglio dell’RNA. In assenza di questi fattori di taglio del trascritto, la velocità della reazione

endonuclesica è lentissima.

I fattori di taglio del trascritto presenti in E.coli sono GreA e GreB. Queste si legano nella regione della RNA

polimerasi in cui l’estremità 3’ dell’RNA nascente protrude.

112

Queste proteine, inoltre, posizionano uno ione metallico nel sito attivo dell’enzima, per esempio uno ione

2+

Mg . Questo ione metallico, a sua volta, attiva una molecola d’acqua per fare avvenire la reazione di

idrolisi del legame fosfodiesterico (editing idrolitico).

Viene quindi tagliata la porzione di RNA protrusa eliminando l’estremità 3’ del trascritto di RNA, rendendo

possibile il recupero della trascrizione.

Il taglio di questa porzione di RNA potrebbe eliminare eventuali errori a livello di basi, o degli impedimenti

fisici.

TERMINAZIONE

Una volta che l’RNA polimerasi ha trascritto un intero gene o più geni (operone), questo enzima si deve

fermare in un punto preciso, deve quindi lasciare il filamento trascritto, lasciare libero il DNA stampo e

staccarsi esso stesso dal DNA.

La RNA polimerasi blocca la trascrizione a livello di una sequenza specifica di DNA sul filamento stampo,

queste regioni sono dette terminatori della trascrizione.

Quindi le due sequenze principali della trascrizione hanno esattamente funzione opposta:

- il promotore è la sequenza che guida l’inizio della trascrizione;

- il terminatore è la sequenza che blocca la trascrizione.

Per regolare la quantità di RNA, e quindi per controllare la regolazione dell’espressione genica, si può

intervenire in diversi punti: a livello del promotore, nella fase di allungamento, ma anche nella

terminazione.

Nei batteri ci sono due tipi di terminatori:

 terminatori intrinseci

 terminatori Rho dipendenti

 TERMINATORI INTRINSECI (batteri)

La RNA polimerasi può bloccare la trascrizione in assenza di altri fattori, a livello di determinate sequenze

terminatrici dette terminatori intrinseci (o terminatori semplici o terminatori Rho indipendenti).

Sul filamento stampo di DNA la sequenza terminatrice intrinseca ha due caratteristiche:

 la sequenza presenta delle sequenze di basi ripetute e invertite (complementari)

 la sequenza presenta circa 8-10 residui di adenine (poliA).

Queste due caratteristiche della sequenza terminatrice comportano rispettivamente che:

 l’RNA assume una particolare struttura secondaria: le due sequenze complementari e invertite sul

RNA trascritto si appaiano, così che l’RNA si ripiega su se stesso e forma una forcina, detta stem-

loop

 alla fine del trascritto di RNA è presente una sequenza di poliU. 113

Le sequenze di poliA e di poliU si appaiono formando l’ibrido RNA-DNA, ma questa struttura è instabile

perché le basi A e U sono unite da legami deboli.

L’apertura di questa regione all’interno della bolla di trascrizione dovrebbe bloccare la trascrizione, mentre

la struttura a forcina dell’RNA induce lo spostamento del trascritto di RNA fuori dal sito attivo dell’enzima,

nonché il rilascio dell’enzima stesso. Avviene quindi la dissociazione dell’intero complesso.

 TERMINATORI RHO DIPENDENTI

In molti casi la sequenza di DNA non ha informazioni sufficienti per terminare la trascrizione, per cui questi

siti di terminazione (detti terminatori enzimatici) necessitano di proteine che aiutino la RNA polimerasi a

terminare la trascrizione.

Alcuni geni di E.coli dipendono infatti dalla proteina Rho per terminare la trascrizione, e di conseguenza

questi siti terminatori sono detti Rho dipendenti.

A livello del DNA il terminatore Rho dipendente è costituito da una sequenza ricca in C sul filamento

codificante, seguita da due brevi sequenze ripetute e invertite.

Di conseguenza l’RNA trascritto presenterà la sequenza Rut ricca di citosine, e seguita ad una certa distanza

ci sarà una breve forcina. Per cui la sequenza terminatrice è diversa dalla sequenza Rho indipendente.

La proteina Rho appartiene alla famiglia delle elicasi. E’ una proteina esamerica con attività ATPasica, e si

presenta nella forma ad anello aperto.

Per terminare la trascrizione la proteina lega le sequenze ricche in C sulla catena nascente di RNA trascritto.

Questa proteina si carica sulla molecola di RNA grazie alla sua forma ad anello aperto.

In modo particolare la proteina Rho è costituita da sei domini di legame all’RNA. Una volta che l’RNA è

legato all’interno dell’esamero nei suoi domini, si suppone che l’anello si chiuda e che cicli seguenti di

idrolisi dell’ATP da parte di Rho guidano scambi strutturali, e spingano l’RNA all’interno dell’anello e quindi

fuori dalla RNA polimerasi.

114

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

Il processo di trascrizione è identico tra procarioti ed eucarioti tuttavia vi sono delle differenze nei

macchinari utilizzati in ciascun caso:

 gli eucarioti possiedono tre RNA polimerasi: Pol I, II e III;

 la struttura dei promotori è diversa;

 negli eucarioti sono richiesti diversi fattori di inizio chiamati fattori di trascrizione generali;

 l’apertura della doppia elica richiede idrolisi di ATP ;

 in vivo è inoltre richiesto il complesso mediatore ed altre proteine regolatrici;

 per l’allungamento è richiesta la fosforilazione della RNA polimerasi;

 sono richiesti enzimi che modificano la cromatina: per trascrivere il DNA la cromatina deve essere

sciolta, cioè il DNA deve essere liberato dai nucleosomi;

 a differenza dei batteri, l’RNA eucariotico prodotto non è ancora pronto per la traduzione (presenza

di introni ed esoni), per cui deve subire delle modificazioni chimiche, cioè deve essere maturato:

splicing, capping, poliadenilazione;

 l’RNA maturo deve essere trasportato fuori dal nucleo: gli eucarioti, a differenza dei procarioti,

hanno il nucleo, per cui l’Mrna verrà sintetizzato nel nucleo.

I ribosomi sono però nel citoplasma, per cui un sistema dovrà trasportare l’Mrna dal nucleo fuori

nel citoplasma a livello del ribosoma ===> negli eucarioti trascrizione e traduzione avvengono

quindi separatamente.

I batteri sono invece privi di nucleo, per cui mentre l’RNA polimerasi sta formando un mRNA,

ancora prima di arrivare al terminatore si hanno già le condizioni per legare un ribosoma e tradurre

una proteina.

 RNA POLIMERASI DI BATTERI, ARCHEA, EUCARIOTI

I batteri e gli archea possiedono una sola RNA polimerasi, mentre gli eucarioti ne possiedono tre.

I batteri, inoltre, possiedono enzimi di piccole dimensioni, mentre archea ed eucarioti possiedono

polimerasi più complesse e di dimensioni maggiori.

Nonostante queste differenze, le RNA polimerasi di questi tre regni hanno la stessa architettura, e questo

dimostra che tali enzimi utilizzano lo stesso meccanismo per trascrivere e sintetizzare RNA a partire da

DNA. Inoltre questa conservazione evolutiva dell’enzima core dimostra anche che tutte le RNA cellulari si

sono evolute a partire da un antenato comune (omologia strutturale).

 RNA POLIMERASI EUCARIOTICHE

Ognuna delle tre polimerasi eucariotiche ha una propria funzione:

- RNA polimerasi I: dirige la trascrizione dei lunghi geni codificanti per gli RNA ribosomiali rRNA;

- RNA polimerasi II: mRNA;

- RNA polimerasi III: tRNA e piccoli RNA nucleari.

Queste tre polimerasi hanno tre promotori diversi. Inoltre il promotore verrà riconosciuto solo se ci sono

specifiche proteine: i fattori di trascrizione generale.

A differenza dei batteri le RNA polimerasi eucariotiche sono costituite da molte più subunità: 10 subunità.

In aggiunta a queste ognuna della tre polimerasi eucariotiche possiede altre subunità diverse, responsabili

delle loro diverse funzioni. Inoltre, il fattore sigma, fondamentale nei batteri, non è presente negli eucarioti

e negli archea: ci sono i fattori di trascrizione. 115

 LA RNA POLIMERASI II

La RNA polimerasi II eucariotica accoppia alla trascrizione anche la maturazione dell’RNA, producendo in

tale modo un mRNA maturo.

Questa funzione è dovuta ad una peculiare caratteristica di questa polimerasi, ovvero la presenza di un

dominio addizionale: il dominio C-terminale (CTD). Questo dominio aggiuntivo è funzionalmente molto

importante.

In modo particolare la RNA polimerasi II presenta

una subunità Rpb1 che è