Appunti di Biochimica metabolica e funzionale

BIOCHIMICA METABOLICA E FUNZIONALE 02/10/2018

Biochimica o chimica biologica → Riguarda le basi chimiche della vita a livello molecolare.

Biologia chimica → Applicazione di tecniche/strumenti chimici al fine di manipolare sistemi biologici. Es: Genome

mining di un microrganismo (Klebsiella pneumoniae) per trovare vie metaboliche su cui possa agire un nuovo Ab.

Biologia dei sistemi → Visione integrata di un sistema biologico. Es: Integrazione del genoma, del trascrittoma, della

proteomica e della metabolomica.

Metabolismo → 3 definizioni:

• Insieme dei processi che costruiscono e distruggono la materia vivente attraverso processi chimici.

L’obiettivo è di convertire l’energia e di trasformarla in diverse forme chimiche, al fine di rendere possibili

i processi vitali.

• Rimuovere il “vecchio” tramite catabolismo per sostituirlo con il “nuovo” tramite anabolismo.

• Processo generante energia (ATP) tramite catabolismo e generante macromolecole per il mantenimento e

la crescita delle cellule attraverso vie anaboliche.

Livelli di regolazione dei sistemi biologici:

• Trascrizione dei geni.

• Maturazione del DNA co o post trascrizionale → Splicing, capping (5’), poliadenilazione (3’). Servono per

proteggere mRNA da RNAasi e per il riconoscimento da parte del ribosoma per la traduzione.

• Esporto dell’mRNA e delle proteine ad esso complessate. Esse servono a stabilizzarlo o a degradarlo. Es:

microRNA degradano in modo specifico l’mRNA.

• Traduzione.

• Se la proteina prodotta è un enzima, la sua f(x) è regolata a livello di: traslocazione (chaperonine, sistemi

shuttle), stabilità, modificazioni post traduzionali (la + frequente è la fosforilazione), regolazione allosterica.

• Inibizione da parte del prodotto → Importante per l’aspetto farmacologico.

Esempio: La degradazione dell’mRNA avviene attraverso diversi meccanismi a seconda della situazione:

• mRNA senza codone di stop → Viene reclutato l’esosoma (complesso multiproteico con RNAasi).

• mRNA senza codone di inizio → mRNA e complesso RISC → L’mRNA si appaia a mRNA target facendo partire

la degradazione.

• Rimozione del cap al 5’ → Agiscono esonucleasi che tagliano in direzione 5’→3’.

• Deaminazione → A livello del 3’.

RBPs → RNA binding proteins → Coinvolte nella regolazione a livello post trascrizionale. La trascrizione è casuale,

ma la produzione di proteine è molto precisa → Gli eventi post trascrizionali sono fondamentali.

RNA operons → mRNA correlati in modo funzionale.

RNA regulons → Strutture di coordinazione di alto livello dell’mRNA.

Epigenetica → Modifiche che non riguardano le proteine, ma le basi (es: demetilazione citosina) senza modificarne

il messaggio, oppure riguardano proteine che interagiscono con DNA.

FEGATO nel METABOLISMO 04/10/18

Il fegato ha f(x) regolatorie nell’organizzazione della distribuzione dei substrati (messi in circolo per raggiungere

altri organi/tessuti). Attraverso un equilibrio tra secrezione e re-uptake di metaboliti e lipoproteine, il fegato

determina la loro [ ] in circolo.

Circolazione epatica → A differenza degli altri organi, il fegato possiede una doppia circolazione:

• C → Il sangue arterioso arriva attraverso l’arteria epatica e si distribuisce in vasi sempre

IRCOLAZIONE SISTEMICA

+ piccoli fino ad arrivare ai capillari. Poi il sangue venoso si distribuisce in vasi sempre + grossi fino alla vena

epatica.

• C → Riceve sangue venoso dall’intestino attraverso la vena porta e raccoglie il sangue

IRCOLAZIONE PORTALE

refluo dai visceri. Il sangue refluo ha una composizione ≠ a seconda dello stato di nutrizione: a digiuno è

venoso, dopo il pasto contiene ciò che deriva dalla digestione.

Lobulo epatico → Unità morfo-funzionale del fegato → Riconoscibile

anatomicamente e con f(x) specifiche.

La circolazione influenza dal punto di vista strutturale e funzionale

l’anatomia delle cellule.

Nel lobulo epatico si può distinguere una zona periferica (triade

portale), in cui arrivano le diramazioni di arteria epatica, vena porta e

dotto biliare. Al centro si trova la vena centro-lobulare che raccoglie il

sangue venoso e poi converge nella vena epatica.

Le cellule epatiche sono organizzate intorno al sistema capillare in sinusoidi.

Tipi cellulari → Si distinguono diversi tipi cellulari all’interno del lobulo epatico:

• Epatociti → Cellule principali (80%), sedi delle f(x) metaboliche, endocrine e secretorie. Sono cellule

poligonali con i lati che sono a contatto sia con sinusoidi che con gli epatociti adiacenti.

• Cellule endoteliali → Rivestono i sinusoidi, separando le cellule parenchimali e quelle adipose dal sangue

sinusoidale. Sono cellule fenestrate. → Filtrano le sostanze nutritive e costituiscono una barriera contro gli

agenti patogeni.

• Cellule stellate → In condizioni fisiologiche sono quiescenti; sono riserve di vitamina A. Quando il fegato

viene danneggiato in seguito a infezioni, endotossine, metaboliti ad alte [ ], le cellule stellate si attivano e

si differenziano in miofibroblasti, generando una cicatrice temporanea con un ruolo protettivo. → Permette

la rigenerazione degli eritrociti. → Capacità rigenerativa del fegato dovuta alle cellule stellate. Però se la

risposta è prolungata si ha fibrosi.

• Cellule di Kupffer (KC) → Costituiscono l’80-90% dei macrofagi tissutali del nostro corpo. Sono coinvolte

nella risposta del fegato a infezioni, tossine, ischemia, resezione e altri stress.

→ A seconda dei contatti con cellule/strutture adiacenti, l’epatocita ha f(x) ≠:

Polarità delle cellule epatiche

• P → Gli epatociti sono a contatto con spazi in cui si raccoglie la bile.

OLO APICALE

• P → Domini di membrana con cui gli epatociti entrano in contatto con quelli circostanti

OLO VASO LATERALE

fino ad arrivare ai sinusoidi.

Liver zonation → Il fegato non è omogeneo, ma ci sono ≠ tipi cellulari con ≠ f(x)

→ f(x) distinte in relazione alla localizzazione. Si distinguono tre tipi di cellule

in base al fenotipo:

• P → In prossimità della triade portale.

ERIPORTALI

• I .

NTERMEDI

• P → In prossimità della vena centro-lobulare.

ERIVENOSI

Le f(x) zonate sono:

• Metabolismo dei carboidrati.

• Rimozione NH3.

• Formazione, trasporto e secrezione della bile.

• Biotrasformazione dei farmaci.

Storia della zonation:

• 2006 → Le basi molecolari della zonation non sono ancora note.

L’espressione delle proteine zonate può essere:

Statica → Costante nel tempo, sotto al controllo della trascrizione. Es: Glutamina sintetasi (GS),

◊ enzima che si trova negli epatociti perivenosi e che converte il glutammato in glutammina

all’interno del sistema di detossificazione da NH3.

Dinamica → Sotto il controllo di fattori ambientali, che raggiungono il fegato grazie alla circolazione.

◊ → Espressione diversa a seconda dei fattori. Es: PEPCK1, enzima che si trova negli epatociti

periportali e che interviene nella gluconeogenesi. La gluconeogenesi non è costitutiva, ma si ha in

caso di digiuno → PEPCK1 espresso solo in condizioni di digiuno.

• 2009 → Gli epatociti periportali ricevono un sangue misto dalla vena porta (ricco di nutrienti) e dall’arteria

epatica (ricco di O e ormoni). Quelli perivenosi invece, sono esposti a livelli di O2, ormoni e nutrienti minori.

• 2014-2015 → Si è osservata la trasduzione del segnale di WNT che contribuisce alla zonation.

WNT sono proteine che regolano l’interazione tra le cellule durante lo sviluppo.

Sono proteine secrete e solubili.

Sono ligandi di un sistema recettoriale costituito da 2 proteine di membrana: FZD e LRP5/6.

Se WNT è assente o ci sono inibitori di WNT, la β-catenina viene fosforilata e viene

distrutta. Esistono diversi meccanismi che portano alla degradazione della β-

catenina:

WNT viene catturato da un R solubile (sFRP) → Non può interagire con R di

◊ membrana.

Un inibitore (WIF) si lega a R, impedendo l’interazione con WNT.

◊ DKK può inibire intracellularmente WNT.

◊ A livello intracellulare, un complesso contenente β-catenina e APC, un

◊ fattore che regola la trascrizione. Se interagisce con questo complesso, la

β-cat viene trattenuta all’interno della cellula, fosforilata e degradata.

Invece, se il sistema funziona, si ha il legame WNT-R di membrana. → Il segnale si

trasduce all’interno della cellula attraverso la proteina DSH che porta al distacco

della β-catenina dal complesso. In questo modo la β -catenina viene traslocata nel

nucleo dove interagisce con il complesso TCF/LEF, un fattore di trascrizione che

attiva la trascrizione dei geni target.

Questo meccanismo è stato studiato in eritrociti periportali e perivenosi cercando

una correlazione tra i geni e i meccanismi zonati: detossificazione da NH3,

metabolismo dei carboidrati e degli xenobiotici. Si è osservato che negli epatociti:

Periportali → La β-catenina è inibita da DKK, una proteina ricca di Cys che

◊ interagisce con i co-recettori di WNT (LRP5/6) bloccando il segnale di WNT.

APC è espressa, quindi la β-catenina viene trattenuta nella cellula, fosforilata e poi degradata.

Perivenosi → La β-catenina è attiva. APC non è espresso. → β-catenina è espressa.

◊

La β-catenina può regolare l’espressione dei geni in modo positivo o negativo: alcuni sono espressi se c’è la

β-catenina, altri se non c’è.

Es: L’arginasi 1 (Arg1), la fosfoenolpiruvato carbossichinasi (Pepck1) e la glutaminasi 2 (Gls2) sono regolate

negativamente, quindi sono presenti solo negli epatociti periportali, dove la β-catenina non è espressa.

• 2009 → HNF-4 è un fattore di trascrizione coinvolto nell’espressione tessuto-specifica di alcuni geni.

Questo processo è stato studiato durante lo sviluppo e la ricostituzione → Studio delle cellule staminali. Si

è osservato che inizialmente le cellule staminali hanno un fenotipo periportale. Spontaneamente negli

epatociti non zonati (in coltura) prevale il fenotipo periportale. Se WNT è attivo gli epatociti periportali si

trasformano in perivenosi. Il fattore di trascrizione che attiva la trascrizione è LEF1. I geni possono essere

classificati in geni che conferiscono un fenotipo:

Periportale → GLS2, H19, TTR. Se c’è fenotipo PP, HNF-4

◊ viene espresso e si lega a sequenze responsive; Però ci

sono promotori non espressi e quindi HNF-4 non è

sufficiente ad attivare la trascrizione. → In queste

condizioni WNT non è attivo e quindi LEF1 non si lega.

Perivenoso → Cyp1a1 (Detossificazione da xenobiotici),

◊ GS. Aggiungendo BIO, un inibitore di GSK-3 (fattore che

inibisce la fosforilazione della β-catenina), induce

l’attivazione dei geni con fenotipo PV grazie al legame di

HFN-4 con LEF1 e l’inattivazione dei geni con fenotipo PP.

• 2014 → WNT non viene prodotto da epatociti o da macrofagi, ma viene prodotto dalle cellule di Kupffer →

β-catenina si attiva durante la rigenerazione epatica. Il sistema WNT è presente anche nell’intestino, in cui

si è visto che la stabilità del R per WNT (FZD) dipende dall’ubiquitinazione da parte dell’ubiquitina ligasi, e

quindi dalla degradazione → Si può variare la risposta di WNT variando la quantità di R → L’ubiquitina ligasi

si trova sulla membrana, ma ha un dominio extracellulare che interagisce con RSPO, inibitori della ligasi,

che blocca il sistema → FZD non viene ubiquitinato e quindi la β-cat è attiva. → Se c’è RSPO, la β-cat è attiva.

• 2016 → RSPO è importante nella zonation epatica. RSPO è una proteina espressa in modo specifico nelle

cellule endoteliali della zona PV, dove quindi viene espressa β-catenina.

• 2018 → Si è scoperta un’interazione tra glucagone e WNT/ β-catenina. Il glucagone ha un effetto opposto

rispetto al sistema WNT/ β-catenina → Negli epatociti PP i geni sono attivati dal glucagone e inibiti da WNT/

β-catenina. Generando topi KO per il glucagone si è osservato che senza esso non si ha il fenotipo PP.

METABOLISMO DEL GLUCOSIO 09/10/18

Glicolisi → Nel fegato non è una via preferenziale in caso di euglicemia (70-100 mg/dL). Diventa importante in caso

di iperglicemia e di ipossia: la carenza di O2 (usato soprattutto nella zona PP per la fosforilazione ossidativa) può

essere presente nei capillari PP o causata da ischemia. → In queste condizioni la glicolisi fornisce i substrati per i

processi anabolici (lipogenesi).

Metabolismo del glicogeno e gluconeogenesi→ Sia in iper che in ipoglicemia. Permettono di modulare la glicemia

in uno stato stazionario.

Glucosio dopo i pasti:

• ⅓ viene captato dal fegato e immagazzinato sotto forma di glicogeno.

• ⅓ viene usato dal muscolo. Se è in contrazione, Glc viene usato per sostenerla e viene trasformato in CO2.

Se è a riposo, viene immagazzinato sotto forma di glicogeno.

• ⅓ viene usato dal cervello che lo trasforma in CO2.

Pathway Glc:

• U → Captazione da parte di trasportatori che lo internalizzano.

PTAKE

• F → Viene fosforilato a G-6-P per mantenere il gradiente di concentrazione favorendo il

OSFORILAZIONE

trasporto passivo. La fosforilazione serve a diverse vie:

Glicolisi → Il piruvato viene convertito in acetil-CoA che può entrare nel ciclo di Krebs per ottenere

o i cofattori ridotti oppure può essere trasformato in lipidi.

Glucoronazione → Viene trasformato in acido glucoronico, che interviene nella biotrasformazione.

o Esso infatti ha un gruppo carbossilico che gli permette di modificare le molecole in modo che

vengano eliminate dall’organismo.

Via dei pentosi fosfati.

o

Risposta alla glicemia → Il pancreas è una ghiandola sia esocrina (produce enzimi) che endocrina (produce ormoni).

Nella porzione endocrina ci sono due tipi cellulari molto importanti: le cellule α e le cellule β:

• Se c’è un aumento di Glc nel sangue portale (che raccoglie ciò che è stato assorbito nell’intestino), le cellule

β producono insulina, che facilita la captazione e l’accumulo di glicogeno.

• Quando la glicemia scende, si attivano le cellule α che rilasciano glucagone. Esso mobilizza il glicogeno e

attiva la gluconeogenesi

Ci sono sensori che risentono della [Glc] più alta della media, della [ ] di insulina e glucagone, ma non ci sono sensori

che risentono di un abbassamento della [Glc].

R insulina → Espresso in molti tessuti, soprattutto in fegato, tessuto adiposo, milza e ovaie.

R glucagone → R di membrana collegato a proteine G stimolatorie. Molto

espresso nel fegato e nei reni, mentre è poco espresso negli altri tessuti.

È simile al R β-adrenergico attivato dall’adrenalina (rilasciata dopo stress).

Entrambi hanno come II messaggero il cAMP. → Attivano PKA che porta ad

una risposta adrenergica. L’adrenalina raggiunge anche il fegato, dove può

attivare anche i R α-adrenergici che hanno come II messaggero il Ca2+. →

Se ci sono sia glucagone che adrenalina si ha un >>i cAMP e > Ca2+.

→ Ormone che potrebbe avere un ruolo nell’omeostasi di Glc.

Asprosina

È stato scoperto nella sindrome neonatale progeroide, caratterizzata da un

invecchiamento precoce causato da una mutazione del gene FBN1 nel tessuto

adiposo. FBN1 è il gene che codifica la proteina precursore profibrillina che può

andare incontro a taglio proteolitico generando 2 prodotti; uno di questi è

l’asprosina. L’asprosina ha un R che risente della sua [ ] epatica.

L’asprosina funziona come il glucagone (R è simile) aumentando cAMP

intracellulare nel fegato → Rilascio Glc che entra in circolo → Arriva al pancreas

che risente dell’aumento della glicemia e rilascia insulina. → Un’eccessiva

stimolazione può portare ad iperinsulinemia.

Usando un Ab anti-asprosina si impedisce il legame con R epatico e quindi l’aumento di Glc e l’iperinsulinemia.

Zonation epatica:

• PV → Glc viene fosforilato grazie a GK a G-6-P. Glc viene incanalato verso la glicolisi e dopo un tot di reazioni

si ottiene fosfoenolpiruvato, che viene trasformato in piruvato dalla piruvato chinasi.

Essendoci poco O2, il piruvato può essere convertito in lattato dalla lattato deidrogenasi (che può

catalizzare anche rx inversa). Il lattato può uscire dall’epatocita attraverso il trasportatore degli acidi

monocarbossilici.

• PP → In condizioni di ipoglicemia si attiva la via inversa della glicolisi, cioè la gluconeogenesi (PEPCK, FBPase,

G-6-P fosfatasi) anche a partire dal lattato.

Sistema di controllo di protein chinasi e fosfatasi → I siti di fosforilazione sono Ser, Thr e Tyr.

• Protein chinasi → Le protein chinasi trasferiscono un P dall’ATP a queste tre residui. Ci sono 2 tipi di protein

chinasi: Serina/Treonina chinasi → Sono circa 400 e hanno circa 25 Ser/Thr fosfatasi corrispondenti → Poca

◊ specificità.

Tirosin chinasi → Sono circa 100 con circa 100 Tirosin fosfatasi corrispondenti → Molto specifiche.

◊

• Protein fosfatasi:

PP1 → Protein fosfatasi 1 → È la Ser/Thr fosfatasi + importante. È ubiquitaria, quindi è coinvolta in

◊ molti processi, ma è poco specifica. È un complesso dimerico costituito da una subunità catalitica

che idrolizza P e da una subunità regolatoria.

PP2A → Protein fosfatasi 2&d