Appunti di biochimica applicata

SCHEMA REPORTER

Sono ampiamente usati per lo studio della regolazione dell'espressione genica in cellule eucariotiche. Per effettuare l'analisi quindi occorre clonare le sequenze regolatorie di interesse a monte di un gene reporter in un vettore, poi avviene la trasfezione in cellule eucariotiche. Infine si valuta l'espressione genica del reporter.

Un esempio è l'analisi funzionale del promotore con delezioni, in cui la valutazione avviene confrontando la lunghezza del promoter con la sua attività. Sulla sinistra sono riportati diversi vettori con promotori di diversa lunghezza, sulla destra la loro attività % in base al tipo selvaggio. Tra il 2° e il 3° vettore come anche tra l'8° e il 9° l'attività si riduce drasticamente: ciò significa che nei nucleotidi che sono stati tolti erano presenti degli enhancer, cioè elementi che promuovono la trascrizione. Togliendo questi, l'attività del reporter diminuisce.

promotore equindi anche del vettore si riduce. Al contrario, tra il 5° e il 6° come anche tra il12° e il 13° l’attività aumenta anche se la lunghezza del promotore diminuisce:ciò significa che nei nucleotidi che vengono tolti erano presenti dei silencer,cioè elementi che ostacolano la trascrizione. Togliendo questi, l’attività delpromotore quindi anche del vettore aumenta.

Per effettuare queste modifiche servono dei mutanti di delezione, ottenuti conla PCR. Dunque con studi mutazionali si può capire se un elemento delpromotore è un silencer o un enhancer, quindi se promuove o sfavorisce latrascrizione, e anche in che maniera la fa.

Un altro metodo di valutazione può essere il controllo della luciferasi, che inpresenza di ATP e luciferina forma l’ossiluciferina producendo luce. Se ilpromotore ha un’alta attività significa che la luciferasi prodotta sarà maggiore,quindi la

La quantità di luce emessa e rilevata sarà grande. Al contrario, se la quantità di luce emessa è poca significa che la luciferasi prodotta è poca, quindi che il promotore ha una bassa attività.

11-PCR (reazione a catena della polimerasi) è la tecnica di studio degli acidi nucleici che ha contribuito maggiormente all'asemplificazione tecnologica, alla diffusione e allo sviluppo della biologia molecolare negli ambiti di ricerca e diagnostica clinica. Viene utilizzata su diversi campioni biologici (siero, tracce di sangue, tessuti, lisato cellulare, urine e feci, cellule di sfaldamento della mucosa orale, capelli, spermatozoi, ossa, denti, fossili...) in diversi campi come caratterizzazione batterica, quantificazione di DNA o RNA, diagnostica prenatale, tipizzazione HLA, identificazione personale, studio di organismi transgenici e diagnostica di malattie oncologiche e studi sulla predisposizione.

Permette di amplificare sequenze di DNA o cDNA.

La PCR (Polymerase Chain Reaction) consiste nella sintesi enzimatica in vitro di segmenti specifici di DNA, grazie all'enzima DNA polimerasi. Il frammento di DNA si accumula esponenzialmente grazie al ripetersi di 30-40 cicli costituiti da denaturazione del DNA - appaiamento dei primer - sintesi di nuovo DNA.

I reagenti necessari per la PCR sono:

• DNA polimerasi: isolata dal Thermus aquaticus (TAQ) che vive intorno ai 70°C quindi questa polimerasi è in grado di lavorare ad alte temperature senza denaturarsi (a differenza di quella umana);
• DNA di partenza: può essere genomico, plasmidico o cDNA;
• Primer: danno la specificità del frammento da amplificare;
• Desossiribonucleotidi trifosfato (dNTP);
• Tampone: per mantenere il pH=8.3, solitamente si usa KCl;
• MgCl2: cofattore della DNA polimerasi, serve per stabilizzare i legami idrogeno tra le nuove eliche di DNA che si formano.

Questi vengono assemblati in provette da 0.2ml con un tappo bombato che consente di mantenere il

interesse ma continuano anche oltre la sua fine. Nel 2° ciclo i primer si posizionano sui frammenti lunghi nel punto che corrisponde alla fine del segmento di interesse. Così alla fine del 2° ciclo si avranno 2 copie del segmento di interesse. Il 1° ciclo non viene quindi considerato un vero e proprio “ciclo di amplificazione” perché produce solo i frammenti lunghi. Dopo n cicli avremo 2 copie della sequenza originaria.

I prodotti della PCR possono essere poi separati con elettroforesi in gel di agarosio o capillare per valutare la presenza del target, riconoscere mutazioni o delezioni e quantificare i prodotti. Possono anche essere tagliati con enzimi di restrizione per riconoscere gli alleli e rivelare mutazioni oppure possono anche essere ibridati con sonde oligonucleotidiche specifiche per la tipizzazione. Possono anche essere sequenziati per ricercare mutazioni non note o per essere clonati.

EFFICIENZA DELLA PCR

La quantità di DNA amplificato in

PCR si calcola come Y = X * (1 + E) con X lan-1 quantità di DNA prima della PCR, E l'efficienza dell'amplificazione e n il numero di cicli. Ottimizzando la PCR si influisce anche sulla quantità di DNA amplificato: se l'efficienza è del 100% i frammenti presenti al ciclo n raddoppiano ciclo n+1.

La PCR può essere ottimizzata migliorando parametri:

• Fisici: tempo e temperatura, denaturazione, appaiamento ed estensione;
• Chimici: concentrazione e tipo di enzimi, concentrazione di MgCl e dei 2dNTP, concentrazione e sequenza di basi dei primer;
• Di protocollo: si può usare una polimerasi Hot Start che è complessata con un anticorpo così che, quando si aumenta la temperatura, l'anticorpo rilascia la polimerasi che è molto più stabile. Invece le polimerasi High Fidelity garantiscono l'aggiunta di nucleotidi sempre giusti.

Inoltre, si può anche agire sui primer per ottimizzare la PCR.