Appunti di biochimica applicata

Approccio investigativo

Il processo investigativo inizia dall'osservazione e dalla documentazione, che portano alla formulazione di alcune ipotesi, cioè possibili spiegazioni di un evento osservato. La loro validità deve essere verificata con degli esperimenti e l'analisi dei risultati ottenuti deve essere effettuata con test statistici. Poi si verifica l'ipotesi più probabile con ulteriori esperimenti: le ipotesi che non presentano contraddizioni e resistono ai test diventano teorie.

L'approccio investigativo si divide quindi in 3 fasi: disegno sperimentale e lavoro di progettazione, raccolta ed espressione dei dati, interpretazione dei risultati.

Lavoro di progettazione

Il lavoro di progettazione consiste nel disegnare l'esperimento iniziando con esperimenti pilota che prendono in considerazione ipotesi semplici e pochi campioni. Bisogna quindi definire lo scopo dell'esperimento, la descrizione dettagliata di materiali e metodi, le osservazioni sui risultati, le conclusioni e i suggerimenti per i successivi esperimenti.

Analisi statistica

L'analisi statistica serve per controllare la variabilità strumentale, quella biologica e la significatività dei dati. Per le prime due si definisce la necessità di ripetere la misurazione nell'ambito dello stesso esperimento (effettuare quindi delle repliche) o di ripetere l'intero esperimento. Per fare ciò si tiene conto della media, della deviazione standard e del coefficiente di variazione. Invece, per la significatività dei dati si utilizza il test t che permette di confrontare due gruppi di dati e indicare se sono significativamente diversi tra loro oppure no. Inoltre, l'analisi permette di definire le correlazioni tra diverse variabili:

• Lineare: y=ax+b con a l'inclinazione, b l'intercetta sull'asse delle ordinate e r il coefficiente di correlazione. Esempi di correlazione lineare sono: lo studio di un'attività biologica in cui l'effetto viene misurato in funzione della concentrazione del tempo di un farmaco o di un inibitore; le curve di calibrazione dell'analisi quantitativa in cui la risposta strumentale è correlata alla concentrazione dell'analizza; il confronto tra due metodi in cui la stessa variabile viene misurata con due metodi diversi;
• Non lineare: come la velocità enzimatica in funzione della concentrazione del substrato o il test della tolleranza al glucosio che indica l'andamento della glicemia nel tempo dopo la somministrazione di glucosio.

Espressione dei dati

L'espressione dei dati serve, invece, per esprimere graficamente i risultati quindi permette di comunicare informazioni in modo immediato utilizzando grafici e tabelle. I grafici devono essere esplicativi e corredati da una leggenda comprensibile. Il grafico a barre viene utilizzato, per esempio, per l'effetto di un antibiotico sulla crescita batterica, mentre il grafico a torta per l'abbondanza dei gruppi sanguigni nell'uomo. I diagrammi di Venn mostrano tutte le ipotetiche, possibili e logiche relazioni tra serie finite: vengono utilizzati, per esempio, per mostrare come il trattamento di cellule muscolari con alcuni inibitori modifichi l'espressione di alcuni geni. Le tabelle, invece, permettono di comunicare informazioni ed effettuare confronti appropriati.

Interpretazione dei risultati

L'interpretazione dei risultati serve per determinare se il modello sperimentale utilizzato si sia rivelato valido e se il disegno sperimentale si sia rivelato corretto (quindi se è stato scelto il giusto controllo positivo o negativo). Permette, inoltre, di verificare che i risultati ottenuti rispondano all'ipotesi iniziale e l'eventuale presenza di informazioni non previste inizialmente.

Le prime applicazioni del metodo investigativo

Fino al '600 la teoria ritenuta corretta è quella della generazione spontanea di insetti, molluschi e piccoli vertebrati. Questa teoria viene poi smantellata dal medico e scienziato Redi, che si basa su un'innovazione metodologica: non fa più riferimento alle dispute filosofiche ma unicamente alle esperienze "iterate e reiterate", quindi a esperimenti impostati, pensati e realizzati in modi completamente nuovi.

Redi utilizza 8 recipienti riempiti di vari tipi di carne: 4 li lascia all'aria aperta (campioni sperimentali) e 4 li sigilla (per il controllo negativo). L'unica differenza tra i campioni e i contenitori di controllo è quindi il contatto con l'aria esterna e con gli insetti. I risultati dell'esperimento vengono, però, obiettati: la chiusura ermetica dei recipienti, impedendo l'afflusso d'aria, potrebbe aver alterato le normali condizioni che garantiscono il ciclo vitale delle larve e quindi compromesso l'esito. Redi quindi rifà l'esperimento ma ponendo i recipienti di controllo non sigillati ma rivestiti da garze, che permettono l'ingresso di aria ma non di insetti. Così, egli osserva la nascita di nuovi insetti solo nei recipienti campione e conclude che questi non si generano spontaneamente ma in seguito alla riproduzione di altri insetti.

Spettrofotometria

Spettro e radiazioni

Le onde elettromagnetiche sono prodotte dal movimento di particelle cariche elettricamente, che si propagano nel vuoto, nell'aria e in altre sostanze. Queste onde sono anche chiamate radiazioni elettromagnetiche perché irradiano dalle particelle cariche elettricamente. Lo spettro elettromagnetico è il range di tutte le possibili radiazioni elettromagnetiche. È diviso in 7 regioni in base alla lunghezza d'onda e alla frequenza:

• Raggi γ: con lunghezze d'onda di 0.01nm e frequenze di 10²¹ Hz;
• Raggi x: con lunghezze d'onda da 1nm fino a 6nm e frequenze di 10¹⁹ Hz;
• UV (ultravioletto): con lunghezze d'onda comprese tra 100 e 350-400nm e frequenze di 10¹⁶ Hz;
• Visibile: con lunghezze d'onda comprese tra 380 e 760nm e frequenze di 10¹⁵ Hz. È quella parte dello spettro elettromagnetico che cade tra il violetto e rosso includendo tutti i colori percepibili dall'occhio umano;
• IR (infrarosso): con lunghezze d'onda comprese tra 0,7μm e 0,4mm e frequenze di 10¹⁴ Hz;
• Microonde: con lunghezze d'onda di 10^-2 cm e frequenze di 10¹² Hz;
• Radiofrequenze: con lunghezze d'onda di 10² cm e frequenze di 10⁸ Hz.

Spettrofotometria di assorbimento

È interessata ai fenomeni di assorbimento delle radiazioni luminose nella regione dello spettro elettromagnetico visibile (400-750nm) e ultravioletto (190-400nm). Il cromoforo è la parte della molecola responsabile del suo colore: il colore aumenta quando la molecola assorbe delle radiazioni della luce visibile. Quando ciò accade, il cromoforo può trasmettere o riflettere altre lunghezze d'onda della radiazione oppure assorbirla eccitando un elettrone dal suo stato fondamentale al suo stato eccitato. Per esempio, l'acetone e il nitrometano assorbono a lunghezze d'onda massime di 271nm, l'acetaldeide a 293nm, l'acetamide a 208nm e l'acetonitrile a meno di 160nm. Il cromoforo è il gruppo funzionale dell'analita che dà origine a picchi distinti in uno spettro di assorbimento, quindi l'assorbimento delle radiazioni da parte di molecole contenenti gruppi cromofori produce delle transizioni energetiche degli elettroni esterni, sia di legame che di non legame. Questi elettroni sono di due tipi:

• σ: costituiti da una nube elettronica addensata lungo l'asse di unione dei nuclei degli atomi interessati al legame (legami semplici);
• π: costituiti da coppie di elettroni la cui maggior densità elettronica è situata al di fuori dell'asse di unione dei nuclei (legami doppi o tripli). Sono meno legati quindi più facilmente eccitabili.

Le transizioni energetiche che possono avvenire sono di 4 tipi: σ --> σ^* (110-135nm), σ --> π^* e n --> σ^* (160-255nm), n --> π^* (>285nm). Alcuni sostituenti sul cromoforo causano un aumento della lunghezza d'onda di assorbimento, diminuendo l'energia necessaria per la transizione: effetto batocromico (come nel caso di doppi legami coniugati). Invece, la diminuzione di doppi legami o la protonazione di un gruppo causano una diminuzione della lunghezza d'onda di assorbimento, aumentando l'energia necessaria per la transizione: effetto ipsocromico.

Quando non si hanno cromofori o se ci sono delle interferenze viene utilizzata la colorimetria in cui l'analita può agire in diversi modi:

• Raramente assorbe a una sola lunghezza d'onda del visibile senza interferenze;
• Si lega a un cromoforo formando un addotto che assorbe una data lunghezza d'onda;
• Reagisce con alcune molecole per formare un cromoforo.

Gli spettrofotometri sono gli strumenti che permettono di determinare lo spettro elettromagnetico in una spettrofotometria di assorbimento. Questi sono costituiti da:

• Sorgente luminosa: lampada allo xeno per tutto lo spettro UV visibile, lampada al tungsteno per il visibile (350-700nm) o lampada al deuterio per l'UV (190-350nm);
• Monocromatore: scompone la radiazione policroma nelle sue componenti e seleziona un determinato e ristretto intervallo di lunghezze d'onda (banda passante);
• Cuvetta: dove viene riposto l'analita, è in quarzo, plastica o vetro (non per l'UV). L'analita deve essere sciolto in un solvente in grado di sciogliere tutti i campioni ma che sia trasparente alla lunghezza d'onda di analisi. Solitamente viene usata l'acqua distillata perché tutti gli altri solventi hanno una lunghezza d'onda critica ("di cut-off") nella regione UV sotto la quale assorbono troppo per consentire l'analisi del campione (si rivelerebbe solo la risposta del solvente). Però l'acqua non scioglie composti organici apolari;
• Fotomoltiplicatore: amplifica il segnale;
• Registratore: converte il segnale in un output numerico.

La trasmittanza è la frazione di luce incidente a una specifica lunghezza d'onda che passa attraverso un campione: T=I₀/I con I₀ l'intensità del raggio in entrata e I l'intensità del raggio in uscita. Per il quarzo la trasmittanza aumenta esponenzialmente e velocemente nell'UV mentre nel visibile rimane costante e viene rilevata fino a 500nm. Invece, per il vetro e la plastica aumenta lentamente nell'UV ed esponenzialmente nel visibile fino a 600nm, poi rimane costante. Infine, per il vetro ottico aumenta lentamente fino 400nm.

La spettroscopia di assorbimento si basa sulla legge di Lambert-Beer, che può essere applicata a sostanze pure e in assenza di interferenze alla lunghezza d'onda considerata, secondo la quale l'assorbanza A = log(1/T) = ε * b * c con ε la costante di assorbimento, b il percorso ottico in cm e c la concentrazione dell'analita. Il coefficiente di estinzione molare, che si calcola in L/(mol*cm), misura l'estinzione di una soluzione contenente 1M in un percorso ottico di 1cm e in condizioni standard di lunghezza d'onda, solvente e temperatura. Invece, il coefficiente di estinzione percentuale, E% che si calcola in 100ml/(g*cm), misura l'estinzione di una soluzione contenente 1g in 100ml in un percorso ottico di 1cm e in condizioni standard di lunghezza d'onda, solvente e temperatura. Se si ha una miscela contenente più analiti, l'assorbanza totale sarà data dalla somma delle assorbanze di tutti gli analiti. Se, però, un analita ha il suo massimo di assorbimento in corrispondenza di un minimo di assorbimento dell'altro analita, sarà: A = A_x + A_y = b*(ε_x*C_x + ε_y*C_y). Quindi, per trovare l'assorbanza totale bisogna risolvere un sistema contenente queste equazioni: A₁ = b*(ε_x1*C_x + ε_y1*C_y) e A₂ = b*(ε_x2*C_x + ε_y2*C_y) con ε_x1 e ε_y1 i coefficienti di estinzione molare dei composti alla lunghezza d'onda 1, e ε_x2 e ε_y2 i coefficienti di estinzione molare dei composti alla lunghezza d'onda 2.

L'effetto ipocromico si verifica quando una molecola che contiene diversi cromofori ha un'assorbività minore della somma delle assorbività dei singoli cromofori alla stessa lunghezza d'onda. Invece, l'effetto ipercromico si verifica quando in una soluzione aumenta l'assorbività a causa di cambiamenti strutturali della molecola. Questo avviene per esempio quando il DNA viene denaturato dal calore: infatti, il DNA a singolo stampo assorbe maggiormente nell'UV rispetto al DNA a doppio stampo che contiene dei legami a ponte idrogeno che limitano il movimento degli elettroni π. La denaturazione del DNA inizia in corrispondenza di regioni ricche di AT: quindi, dove il DNA contiene maggiormente GC sarà più stabile. Il DNA è più stabile a temperature di fusione maggiori: quindi la temperatura di fusione in condizioni standard è indicativa del contenuto in basi del DNA.

Analisi quantitativa

È il procedimento per confrontare la risposta derivante dalla miscela in esame con la risposta di una miscela con composizione uguale ma a concentrazione nota (standard di riferimento). Questo confronto avviene grazie alla curva di calibrazione che correla il segnale (su y) alla concentrazione (su x). L'analisi quantitativa richiede alcuni passaggi per costruire una curva corretta:

• Scelta del metodo analitico: in base alla precisione richiesta e alla sensibilità del metodo;
• Scelta del campione da analizzare e preparazione: importante sapere come ottenere e conservare il campione, per fare in modo che la sua composizione non si modifichi nel tempo. Spesso è necessario ripetere l'analisi: esistono test statistici che permettono di sapere quanti campioni utilizzare, che aliquota prelevare e quante analisi fare;
• Preparazione dello standard: devono coprire il range di concentrazione entro il quale ci si aspetta di trovare il campione ignoto (consigliabile avere almeno 5 punti);
• Esecuzione delle misure: bisogna individuare l'intervallo di concentrazione per il quale la risposta è lineare, quindi in cui la risposta dello strumento aumenta all'aumentare della concentrazione di analita;
• Valutazione dei risultati e stima della loro affidabilità: la pendenza della curva dà informazioni sulla sensibilità del metodo, mentre i risultati vengono accettati esaminando l'intercetta y della curva di calibrazione e il coefficiente di correlazione lineare di Pearson R. Questo varia tra +1 e -1: quando R=-1 c'è una correlazione negativa quindi tutti i punti stanno su una retta con pendenza negativa; quando R=+1 c'è una correlazione positiva quindi tutti i punti stanno su una retta con pendenza positiva; quando R si avvicina a 0 non c'è correlazione tra x e y.

Specificità = possibilità di dosare un analita senza avere interferenze di altre sostanze.
Sensibilità = capacità dello strumento di riconoscere minime variazioni nella concentrazione di analita, in modo lineare.
Limite di determinazione (DL) = la più piccola quantità di analita che può essere misurata a un livello stabilito di confidenza statistica.
Precisione = misura del grado di concordanza tra i valori ottenuti sullo stesso campione.
Riproducibilità = CV% ottenuto confrontando i risultati delle misure della stessa concentrazione di analita nel campione utilizzando lo stesso metodo analitico ma su strumenti diversi, con operatori diversi, nello stesso giorno (CV% inter-assay) e in giorni diversi (CV% intra-assay).
Accuratezza = indice della concordanza tra il valore ottenuto con il metodo analitico e il valore vero dell'analita nel campione.

Metodi analitici per costruire le curve

Ogni volta che viene attuata una variazione significativa del metodo bisogna rivalidarlo. Quindi se cambia operatore bisogna qualificarlo e verificarne la ripetibilità; se ci sono variazioni di prodotti bisogna verificarne precisione ed esattezza; se si modificano le apparecchiature bisogna ricontrollare LOD, LOQ e curva di taratura; se si modificano altri parametri come la matrice, il campo di applicabilità o il solvente bisogna verificare LOD, LOQ, curva di taratura, precisione ed esattezza.

Nelle curve con standard esterni, lo standard è l'analita stesso che viene aggiunto in concentrazioni note e crescenti in diverse soluzioni, in cui è presente anche la stessa matrice presente nel campione. Si ottiene un valore di risposta dello strumento che aumenta in modo proporzionale all'aumento della concentrazione di analita nelle soluzioni. È fondamentale che la resa di estrazione dell'analita sia sempre costante, altrimenti diminuirebbe la concentrazione di analita nel campione. Quindi questa curva viene utilizzata solo quando non si trova uno standard di riferimento per l'analita, e l'analisi va replicata almeno 3 volte. Il coefficiente R che si ottiene da questa curva non è molto elevato, quindi l'analisi non è molto precisa.

Invece per le curve con standard interni si usano composti di riferimento interni che servono per compensare la variazione di volumi di iniezione nello strumento e per correggere le perdite e gli errori associati alla purificazione del campione. Gli standard interni devono avere caratteristiche chimico-fisiche analoghe all'analita ma essere analiticamente distinguibili da esso, quindi avere diversi tempi di ritenzione e rapporti m/z. Inoltre, devono avere una concentrazione ben definita e non essere presenti in matrice. L'efficacia di questa curva dipende solo dalla concentrazione di analita e standard interno.