Appunti completi di Biochimica avanzata (Ex. Biochimica II)

PROTEINE DI MEMBRANA PROTEINE TRANSMEMBRANA

In biochimica, un recettore orfano è una proteina che ha una struttura simile ad altri recettori identificati ma il cui ligando endogeno non è stato ancora identificato.

Una modalità strutturale alternativa che consente a una proteina di attraversare il doppio strato fosfolipidico è il β-barile. Questa è la struttura caratteristica che è stata identificata nella proteina porina, una proteina che agisce come una specie di poro, localizzata a livello mitocondriale; la porina può essere attraversata in maniera non selettiva da molecole anche di discrete dimensioni; è una proteina integrale di membrana mitocondriale. La struttura che caratterizza una proteina come la porina è chiamata struttura "a β-barile", perché è una struttura rotondeggiante cava che è determinata dalla giustapposizione di tante componenti della proteina medesima, che si organizzano.

con strutture di tipo β. Ognuno di questi tratti in conformazione β costituiscono il β-barile. Queste zone devono a loro volta avere una composizione amminoacidica che le rendano compatibili ad essere inserite all'interno del doppio strato lipidico; quindi, Dorian Fink® Dorian Fink® Dorian Fink® anche queste strutture devono contenere in sequenza amminoacidi apolari, idrofobici. La struttura β-barile non è comunque così abbondante nella composizione delle proteine di membrana. La batteriorodopsina è una delle prime proteine ad esser state identificate, che è una proteina fotoeccitabile ed è costituita da 7 α-eliche, ognuna delle quali è impegnata nell'attraversamento del doppio strato lipidico. Ad ogni modo, le proteine di membrana sono proteine assai complesse perché devono da un lato integrarsi nel doppio strato fosfolipidico, e dall'altro devono però svolgere altre funzioni. Nellarappresenta una proteina dimerica inserita nel doppio strato lipidico, è necessario utilizzare metodi specifici che permettano di mantenere la sua struttura intatta. Inoltre, le proteine di membrana sono spesso presenti in quantità molto basse all'interno delle cellule, rendendo ancora più difficile il loro isolamento e studio. Un altro motivo per cui le proteine di membrana sono state meno caratterizzate rispetto alle proteine solubili è legato alla complessità della loro struttura. Le proteine di membrana sono costituite da una combinazione di eliche alfa, foglietti beta e loop, che conferiscono loro una struttura tridimensionale complessa. Questa complessità rende più difficile l'interpretazione dei dati ottenuti dagli esperimenti di caratterizzazione strutturale. Tuttavia, negli ultimi anni sono stati sviluppati nuovi metodi e tecniche che permettono di studiare le proteine di membrana in modo più dettagliato. Ad esempio, la cristallografia a raggi X e la microscopia crioelettronica sono state utilizzate per risolvere la struttura tridimensionale di molte proteine di membrana. Inoltre, l'utilizzo di detergenti e lipidi mimetici ha permesso di mantenere le proteine di membrana in soluzione, consentendo così di studiarle con tecniche di spettroscopia e di risonanza magnetica nucleare. In conclusione, le proteine di membrana sono rimaste indietro nella loro caratterizzazione strutturale rispetto alle proteine solubili a causa delle loro caratteristiche intrinseche e della complessità della loro struttura. Tuttavia, grazie ai progressi tecnologici, oggi è possibile studiare queste proteine in modo più dettagliato, aprendo nuove prospettive per la comprensione delle loro funzioni e per lo sviluppo di nuovi farmaci.è tutta inserita in un ambiente idrofobico, l’unico modo è di utilizzare deidetergenti che favoriscono l’estrazione di una proteina che è inserita nella membrana. Però, spesso questo processo di estrazione è efficace, ma dà come risultato la denaturazione della proteina.. è tutto un gioco di equilibri molto fini! Si ottiene sì la proteina in soluzione, però ha perso la sua struttura originale, e se ha perso la sua struttura originale è ovvio che non è più in grado di svolgere la funzione. Se noi vogliamo studiarne la struttura fine noi dobbiamo essere certi che la struttura della proteina possa essere mantenuta. Un altro problema relativo allo studio delle proteine di membrana è rappresentato dalla poca quantità di queste proteine a livello delle membrane; ci sono delle proteine, come la Na/K ATP-asi, che sono molto abbondanti a livello della membrana, ma ci sono delle proteine (come

L'adenilato ciclasi) che sono presenti nella membrana in una percentuale bassissima. Essendo poco rappresentate, molte proteine sono difficili da studiare. Con le tecniche che hanno consentito l'espressione ectopica e la produzione di grandi quantità di una stessa proteina ha molto favorito e ha risolto certi aspetti, anche se non li ha risolti tutti. È per questi motivi che, ad oggi, la caratterizzazione di molte proteine di membrana risulta ancora problematica.

Quello che si è cercato di fare è stato quindi costruire dei modelli che dessero un'idea di come una proteina si potesse organizzare, di quale fosse la parte della proteina che guarda fuori, quella che guardava dentro, etc. Informazioni di questo tipo possono infatti essere utili. Uno degli studi che sono stati fatti e che si ritrova illustrato in ogni libro di biochimica è l'indice di idropatia di una proteina. L'indice di idropatia è uno studio che si può

fare a tavolino o al computer, utilizzando la sequenza amminoacidica della proteina. Questo grafico fornisce un'idea di dove la proteina concentra amminoacidi idrofobici in modo tale da consentire a questa zona di attraversare il doppio strato fosfolipidico. L'analisi della proteina, in termini di idropatia (cioè l'affinità per l'ambiente acquoso, che riflette anche la poca affinità per l'ambiente acquoso), consente di analizzare la sua sequenza al fine di identificare la possibile presenza di zone sufficientemente idrofobiche da consentire l'attraversamento del doppio strato fosfolipidico. Il grafico di idropatia può essere costruito in maniera

abbastanza semplice, andando a considerare che ogni aa ha un certo grado di idropatia. Questo grado di idropatia dell'aa è un numero che può essere positivo o negativo, e l'entità di questo numero varia considerando l'amminoacido idrofobico, l'aa non polare, l'aa provvisto di carica ecc. Cioè, a seconda del tipo di aa che si considera, i valori dei singoli aa variano in maniera significativa l'uno rispetto all'altro. Ce ne sono varie di tabelle di polarità, che poi sono state battezzate con i nomi dei ricercatori che hanno fatto i vari studi. Nella tabella della slide abbiamo una scala di polarità che serve a identificare la presenza di eliche transmembrana, proprio alla ricerca di zone della proteina che sono sufficientemente idrofobiche da consentire l'attraversamento del doppio strato lipidico. Ciascun aa ha a fianco un valore, che è un valore di

energia libera di trasferimento; questi valori sono staticalcolati considerando la variazione di energia libera che si realizza quando l’aain questione passa da un ambiente idrofobico ad un ambiente idrofilico.

Quindi, i valori di questa tabella sono stati calcolati misurando il valore di energia libera di trasferimento quando l’aa viene portato da un ambiente idrofobico ad un ambiente idrofilico. Ovviamente l’energia libera di trasferimento di segno negativo indica la situazione determinata da aa che sono polari o provvisti di carica, e che quindi nel momento in cui passano da un ambiente idrofobico a uno idrofilico danno luogo a una variazione di energia libera negativa, ovvero è un passaggio che è termodinamicamente favorito; all’opposto, aa che sono invece idrofobici, se passano da un ambiente idrofobico a uno idrofilico questo passaggio non è termodinamicamente favorito, e quindi la variazione di energia libera ha un valore positivo. Con questo

Il criterio è stata costruita una scala, che consente quindi di andare a misurare l'idropatia di una sequenza amminoacidica della lunghezza di 20 aa (per un'α-elica transmembranaria ci vogliono 20 aa). Si prende la sequenza della proteina e si cominciano a considerare quali sono i primi 20 aa, si va a vedere qual è il valore di energia libera di trasferimento, si fa la somma, e il numero che si ottiene è il valore di idropatia della prima sequenza di 20 aa che, nella proteina, è fatta dall'aa 1 all'aa 20, a partire dall'N-terminale. Questo primo passo è seguito da altri centinaia di passi: nei passi successivi si ripete la stessa cosa, solo che il primo aa della lista non è più il numero 1 ma il numero 2, è come se si facesse una scansione della struttura primaria della proteina prendendo come misura "20" (dal 1 al 20, dal 2 al 21, dal 3 al 23 ecc).. ovviamente, se una proteina

è fatta per 250 aa questo lavoro viene fatto per tantissime volte, finché si arriva fare l’ultima scansione degli ultimi 20 aa che compongono la proteina.

Facendo questo si può costruire un grafico in cui sull’asse delle x viene riportato, come numero di riferimento, il primo aa della finestra dei 20 aa considerati; sull’asse delle y andiamo a porre il valore dell’idropatia, che è la somma dei singoli valori di questa energia libera di trasferimento di ciascuno dei 20 aa che compongono la sequenza.

A seconda poi delle tabelle che vengono seguite e da come i dati vengono elaborati viene posto anche un livello di base che fa da cut-off, come a dire che se l’idropatia non raggiunge un certo valore l’α-elica che si sta considerando non è abbastanza idrofobica.

Qui il criterio adottato è quello che fa dare riferimento per la presenza o meno di una zona idrofobica, ed è superato solamente da una sequenza

(siamo→tra 60 e 80 circa) in questa zona si dice che questa zona può essere una zona che attraversa il doppio stratolipidico, ovvero che si ha a che fare con una proteina che, con una sola α-elica, attraversa il doppio stratolipidico. Questo processo, che può comportare tanti errori, fa parte un po' del passato. Oggi le modalità di studio sono cambiate, però questo serve da guida anche per capire che esistono dei limiti, anche dal punto di vista della termodinamica, che permettono ad una proteina di poter interagire con il doppio strato lipidico oppure no. Lezione #9 Quindi, in base alla composizione amminoacidica di una proteina è possibile fare delle previsioni circa l'organizzazione strutturale delle proteine, in relazione alla loro capacità di essere proteine integrali di membrana, attraverso l'organizzazione di strutture ad α-elica. Questa modalità di procedere, che consente di creare dei modelli secondoi plot di idropatia sono solo uno strumento per analizzare la struttura delle proteine di membrana e non forniscono informazioni sulla loro funzione.