Appunti completi Biochimica e biologia molecolare delle piante, prof Lorenzo Camoni

Processo di formazione delle gibberelline nei plastidi

Nei plastidi, dopo aver formato il precursore lineare a 20 atomi di C geranilgeranil PP, poi ciclizzatoad ent-kaurene. Avvengono poi una serie di ossidazioni nel RE dove l'ent-kaurene è convertito nella primagibberellina, la GA aldeide.

Infine si ha la formazione di tutte le GA a partire dalla GA aldeide nel citosol producendo prima GA12 e poi grazie alle diossigenasi che12idrossilano si formano ulteriori GA fino aquelle attive. La maggior parte delle GA sono dei precursori delle GA biologicamente attive. Nella maggior parte delle piante l'unica GA attiva è la GA1, anche se esistono altre GA.

Sono stati studiati i mutanti di pisello le e il corrispettivo wt: attraverso tecniche di HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) e di GC-MS (gascromatografia-spettrometria di massa) le piante wt hanno un maggior contenuto di GA rispetto a quelle mutate. L'allele Le conferisce la capacità di convertire la GA in GA1, quindi il gene Le codifica per una.

GA idrossilasi che converte la GA in GA .3 20 1La sintesi in Arabidopsis è localizzata nelle gemme apicali e nelle giovani foglie, dimostrato tramite l'uso del gene reporter GA ox::luciferasi. Una volta sintetizzato il trasporto avviene nel floema dove vengono anche trasportati altri metaboliti. La regolazione della sintesi delle GA è attraverso un controllo feedback: alte concentrazioni di GA inibiscono la produzione di ulteriori molecole di GA silenziando la GA idrossilasi e la GA3β 20ossidasi. Il fotoperiodo regola la sintesi di GA: in particolare condizioni di giorno lungo attivano la via per permettere alla pianta di passare dallo stadio vegetativo allo stadio riproduttivo.

Effetti fisiologici: Uno degli effetti è la promozione della crescita del fusto, notata a partire dall'allungamento che si verifica a livello dell'internodo superiore del riso di acqua profonda. In queste piante è presente un aumento dell'estensibilità della

parete cellulare; un’assenza dell’acidificazione dell’apoplasto normalmente conseguenza dell’auxina; un lag time che dura da 40 min a 3 ore; un effetto additivo con IAA.

Questa crescita sembrava potesse dipendere da un’alterazione nella distribuzione di calcio, in particolare ad una diminuzione di calcio a livello della parete portando ad una diminuzione della sua stabilità.

In realtà sembra possa dipendere dall’attivazione dellaxiloglucano-endotransglicosidasi/idrolasi o XET che ha l’attività di tagliare una catena delloxiloglucano, unemipectina e operare un riarrangiamento su un’altra molecola.

Un altro effetto è la stimolazione della divisione cellulare a livello del germoglio incrementando la mitosi. In particolare stimolano la transizione tra la fase G1 e la fase S. Nel riso le GA aumentano l’espressione di varie protein chinasi ciclina dipendenti CDK e di una protein chinasi in grado di attivarla.

Alcune piante

Richiedono basse temperature per germinare (stratificazione) e per fiorire (vernalizzazione). Le GA possono sostituire il trattamento a basse T per produrre questi effetti. È stata studiata la fioritura di Thalapsi arvense: senza il trattamento a basse T si hanno alti livelli di acido ent-kaueronico mentre con il trattamento a basse T si hanno alti livelli di GA principalmente GA. Tra gli altri effetti fisiologici delle GA c'è la regolazione della transizione da stato giovanile a stato adulto. Le GA sono inoltre importanti nell'induzione della germinazione dei semi in diversi modi: attiva la crescita vegetativa dell'embrione, interrompe la dormienza dei semi (insensibilità alle T) e porta alla degradazione dei nutrienti come nel caso della degradazione dell'amido nell'endosperma dei semi di cereali. L'embrione è formato dallo scutello e dall'embrione stesso, poi c'è l'endosperma con all'esterno lo strato dell'aleurone.

Le GA sono sintetizzate a livello dell'endosperma e attivano nelle cellule dello strato aleuronico gli enzimi idrolitici che agiscono a livello dell'endosperma, idrolizzando le macromolecole in composti che il coleottile può sfruttare per la germinazione.

Meccanismo d'azione

Prima di effettuare esperimenti su mutanti vennero effettuati altri tipi di esperimenti:

• Si era notato come nei promotori di geni di risposta alle GA sono presenti elementi caratteristici GARC che presentano sequenze nucleotidiche specifiche: GARE, TATCCAC box e box di pirimidine (si scoprirà poi che sono geni di risposta secondari).
• Questi elementi caratteristici sono simili a elementi del mondo animale riconosciuti da fattori di trascrizione della classe MYB, quindi è stata ipotizzata la presenza di un fattore di trascrizione simile a quelli MYB nelle piante, indotto da una gibberellina. È stato isolato in mais un gene MYB la cui trascrizione è indotta da GA.

È stato poi effettuato un esperimento di3EMSA ed è stato dimostrato che la GA-MYB lega la sequenza nucleotidica GARE.

Per studiare la natura del recettore sono stati effettuati esperimenti biochimici.

I primi esperimenti sono stati effettuati su cellule dello strato di aleurone: i derivatimacromolecolari di GA erano attivi e la microiniezione di GA non dava risposta. Con questi3dati venne ipotizzata la presenza di un recettore di membrana.

Sono poi stati effettuati studi sulle proteine G ed è stato identificato il peptide Mas7 che attivala risposta mentre un inibitore analogo del GTP inibisce la risposta. Infatti il mutante di risonano dwarf1 presenterebbe una mutazione sulla subunità α della proteina G.

Fatti questi studi, vennero quindi studiati dei mutanti.

I mutanti possono avere una mutazione a carico di: un gene biosintetico (fenotipo nano); unregolatore positivo del signaling delle GA che diventa non funzionale (LOF recessiva

fenotipo nano); un regolatore negativo che diventa non funzionale (LOF pianta molto cresciuta); un regolatore negativo che rende la risposta alle GA costitutivamente attiva (dominanti gain of function fenotipo nano). Gli esperimenti poi sono stati effettuati sia in riso che in Arabidopsis quindi si complicano le cose.

Il primo mutante in riso identificato è lo slender (snello) rice 1 o slr1 che presenta un maggiore allungamento rispetto al fenotipo wt. Questo gene ha una mutazione LOF per un regolatore negativo. In orzo esiste un corrispettivo con lo stesso fenotipo chiamato sln1.

In Arabidopsis sono presenti ortologhi di slr1 e sln1: GAI (gibberellin-insensitive), RGA (repressor of ga1-3) e SCR (scarecrow o spaventapasseri che regola il pattern della divisione cellulare durante lo sviluppo della radice) che codificano per proteine della famiglia GRAS.

Esiste però un mutante biosintetico ga1 che ha lo stesso fenotipo di gai in assenza di GA esterne. Il doppio mutante rga/ga1 ha una

localizzazione della proteina RGA: è una proteina nucleare.

Il trattamento con GA riduce i livelli di RGA e tramite il trattamento con inibitore della sintesi di GA endogene si ha un aumento del segnale proveniente da RGA: da questi dati è possibile ipotizzare la presenza di un meccanismo di degradazione.

Nel mutante GOF di RGA anche in presenza di GA si hanno alti livelli di RGA: quindi il dominio di regolazione DELLA, in questo caso mutato, è necessario per la degradazione di RGA indotta dalle GA.

Venne effettuata un'ipotesi per cui RGA quando è in forma attiva non permette la crescita. Il legame con GA inattiva la forma mandandola a degradazione.

Nel caso del mutante nel dominio DELLA, anche in presenza di GA non è possibile indurre la degradazione del repressore.

Nel caso del mutante nel dominio di repressione questo non è in grado di reprimere la crescita.

È stato identificato il mutante spy (spindly) che è in grado di germinare in

presenza di inibitori delle GA. La mutazione è recessiva e LOF e si è pensato potesse derivare dall'inattivazione di un regolatore negativo. Tramite analisi epistatiche si è capito che il gene SPY si trova a monte dei geni GAI/RGA. Siccome SPY è un regolatore negativo tanto quanto GAI/RGA, SPY deve regolarli positivamente.

SPY codifica per una O-N-acetil glucosammina transferasi (OGT). Si è ipotizzato che questo enzima vada a glicosilare i repressori GAI/RGA. Questa ipotesi deriva dal fatto che in molti modelli, anche animali, questo tipo di modifica permette l'ingresso nel nucleo.

Successivamente si è lavorato per analogia e oltre a SPY è stato identificato un altro gene il cui prodotto agisce allo stesso modo di SPY. Questo omologo in Arabidopsis si chiama SEC (secret agent).

A partire dal mutante nano gid2 nel riso si è studiata l'interazione tra le GA e il sistema proteasoma-ubiquitina. Questo mutante è

insensibile alle GA, fenotipo derivante dall'accumulo dislr1, il repressore nel riso.

In Arabidopsis l'ortologo di GID2 è SLY1 che codifica per una F-box simile a GID2.

Una volta scoperta questa F-box si doveva dimostrare l'interazione con i due repressori RGA-GAI.

Questo è avvenuto grazie alla tecnica del doppio ibrido, in particolare sia sulle proteine stesse, che su proteine troncate per capire quali domini della proteina sono fondamentali per l'interazione.

SLY interagisce con RGA e GAI attraverso il dominio GRAS.

È stato identificato un altro mutante in riso, gid1, con fenotipo nano insensibile alle GA, anche se presenta molte più GA attive rispetto al wt (mancanza del feedback negativo).