Appunti completi Biochimica e biologia molecolare delle piante, prof Lorenzo Camoni

Introduzione

Le piante sono organismi sottoposti ad un gran numero di stimoli: fisiologici o di stress (patogeno/temperatura etc.); ed hanno evoluto modalità per rispondere a questi stimoli, percependoli e alterando le loro caratteristiche fisiologiche, la morfologia e lo sviluppo. Il meccanismo attraverso il quale le piante costruiscono una risposta a un segnale è chiamato trasduzione del segnale. I recettori percepiscono il segnale convertendo in una risposta cellulare coinvolgendo quindi processi biochimici.

Vie di trasduzione del segnale

Le vie di trasduzione del segnale sono state chiarite grazie a:

• Analisi di mutanti;
• Geni reporter che ci danno un’indicazione sull’espressione di certi ormoni in alcuni organi;
• Analisi dell’espressione genica tramite Northern blotting (per pochi geni), microarray (analisi di tutti i geni) e dnaseq;
• Localizzazione proteica;
• Interazione proteina-proteina in vitro tramite pull-down assay o anche tramite FRET (Forster Resonance Energy Transfer);
• Interazione DNA-proteina tramite EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay).

Approcci di studio

L’approccio utilizzato per lo studio può essere di tipo:

• Riduzionistico perché la trasduzione del segnale è un processo molto complesso. Si va quindi a semplificare il problema dividendolo in problemi più semplici. Dato un processo fisiologico si identificano le componenti cellulari (geni, proteine, metaboliti) dando un primo modello ipotizzando delle interazioni. Molti caratteri fenotipici derivano da complesse interazioni da un gran numero di geni e l’ambiente. Esistono infatti: geni epistatici che sono geni i cui prodotti modificano l’espressione di altri geni; e geni pleiotropici che influenzano molteplici tratti.
• Olistico grazie a strumentazioni e tecniche avanzate. Secondo questo approccio non è possibile studiare un sistema biologico tramite lo studio delle componenti ma vengono effettuate osservazioni e misure quantitative di più processi simultaneamente e poi avviene l’integrazione dei dati e la loro interpretazione mediante un modello matematico. Tra le tecniche avanzate ci sono: l’analisi del trascrittoma (analisi simultanea dell’espressione di un organismo); del proteoma (composizione quantitativa e qualitativa di un certo tessuto/organo/organismo) e del metaboloma (composizione quantitativa e qualitativa di un certo tessuto/organo/organismo).

Queste tecniche ci permettono di acquisire dati che devono essere identificati e le componenti quantificate tramite data mining. Poi si fa inferenza sulla struttura e la quantità delle interazioni (fisiche e/o funzionali) e si integrano i dati eterologhi (proteoma-trascrittoma-metaboloma) per costruire un modello matematico confermato sperimentalmente.

Risposte agli stimoli

La risposta ad uno stimolo non è data solo dallo stimolo ma anche, ad esempio, dallo stadio di sviluppo, dall’orologio interno e da altre condizioni ambientali. Spesso poi molti segnali possono interagire in maniera cooperativa per una stessa risposta convergendo in un punto detto punto nodale. Il tipo di risposta ad un determinato segnale è altamente variabile tra pianta-pianta ma anche tessuto-tessuto.

Caratteristiche dei sistemi di trasduzione

Le caratteristiche dei sistemi di trasduzione del segnale sono:

• Specificità: esiste uno specifico recettore, spesso una proteina, per un certo segnale, che può essere chimico ma anche di altro tipo come la luce. Questa specificità è data dal legame specifico e selettivo per una certa molecola.
• Amplificazione: il segnale viene amplificato in ogni passaggio creando un incremento di molecole attivate nella cascata di trasduzione, possibile grazie ai secondi messaggeri.
• Desensibilizzazione: una risposta che viene attivata è proprio la disattivazione del recettore tramite feedback negativo per non avere una risposta incontrollata e irreversibile.
• Integrazione: i diversi stimoli sono integrati dalla pianta; infatti nel caso in cui siano presenti due segnali con due recettori, che portano ad una risposta opposta, questi vengono integrati e la risposta dipenderà da quale dei due segnali è a concentrazione più alta.

Recettori

I recettori possono essere:

• Canali ionici come il recettore nicotinico dell’acetilcolina, in cui si ha il passaggio passivo di certi ioni. Il canale è presente in conformazione chiusa o aperta, il legame con l’acetilcolina porta ad un cambio conformazionale dando quella aperta e permettendo il passaggio. In questo caso esiste una desensibilizzazione per una continua eccitazione. Questo tipo di recettori non sono però molto presenti nelle piante.
• Enzimi come il recettore dell’insulina. Il legame al recettore porta all’attivazione o disattivazione dell’enzima.
• A serpentina (presenza di 7 alfa-eliche) che sono associati alle proteine G.
• Recettori steroidei che negli animali si trovano a livello nucleare mentre i brassinosteroidi delle piante hanno un recettore (di membrana?)
• Recettori senza un’intrinseca attività enzimatica

Molte molecole segnale delle piante somigliano strutturalmente a molecole presenti negli animali, come: acido jasmonico e prostaglandina E1; auxina e serotonina (derivanti entrambi dal Trp); o il brassinolide e l’estradiolo.

Identificazione dei recettori

L’identificazione dei recettori può avvenire tramite:

• Metodi biochimici (vecchie tecniche). Tramite questi metodi si produce un ligando radioattivo (ad esempio auxina-trizio) e si aggiunge ad un tessuto della pianta. Vengono frazionati i componenti cellulari tramite la centrifugazione differenziale dopo omogenizzazione, il primo giro porta nel pellet i nuclei e i frammenti cellulari, se la radioattività non è presente nel pellet significa che il recettore non è nel nucleo. Dopodiché si effettua una seconda centrifuga che presenta un pellet ricco di mitocondri. Si effettuano altre due centrifugazioni, la prima che presenta pellet ricco di microsomi (membrane) e la seconda che presenta pellet con ribosomi.

Una volta preso il pellet che presenta la radioattività si effettua purificazione cromatografica con frazionamento e studio dell’assorbanza, facendo tre passaggi sulla frazione con il picco di assorbanza. Si effettua poi elettroforesi-SDS page dando certe proteine anche se il recettore non è più associato al ligando per la denaturazione effettuata dall’SDS.

Un “trucco” utilizzato per risolvere questo problema è l’utilizzo della fotoaffinità: al ligando radioattivo viene legato un gruppo fotoaffine, attivato da luce UV e in grado di legare covalentemente una proteina; la proteina più vicina e quindi più statisticamente probabile per questo legame è il recettore stesso. Effettuando quindi un’autoradiografia è possibile identificare il recettore. Al ligando può anche essere legata una proteina come BSA (bovin sieric albumin) chiamata derivato macromolecolare che non può attraversare la membrana, per stabilire se il sito di legame di un recettore è intra- o extracellulare. Se riesce ad indurre una risposta significa che il recettore si trova sulla membrana con il sito di legame posto nel lato extracellulare, in caso contrario significa o che il recettore si trova all’interno oppure che si trova in membrana ma con il sito di legame dal lato intracellulare.

• Metodi di biologia molecolare e analisi di mutanti (più moderni). Una possibilità è la mutagenesi che permette di effettuare mutazioni casuali sul genoma. Dato il grosso numero di organismi si riuscirà statisticamente ad avere una mutazione di interesse, ossia mutanti insensibili al segnale, identificati tramite il trattamento con il segnale. Si va a mappare la mutazione (tramite chromosome walking) e si può poi andare ad esprimere il gene wt in altre cellule ed effettuare un saggio di legame in vitro.

Un’altra possibilità è la complementazione di mutanti in lievito: si possono isolare in lievito mutanti per il carattere della pianta d’interesse; poi si effettua una libreria di cDNA di pianta tramite trascrittasi inversa che produce diversi cDNA di pianta che vengono inseriti in un vettore (E.Coli/lievito); infine si trasformano le cellule di lievito con la libreria di cDNA di pianta per fare in modo che almeno alcuni cloni siano in grado di ritornare al wt. Una volta identificati questi cloni si va a studiare la sequenza inserita che ha permesso di avere in queste cellule la funzione studiata.

Requisiti essenziali per l’identificazione del recettore

• Il legame deve essere ad affinità relativamente alta
• Il legame deve essere reversibile e deve rispondere a variazioni di concentrazioni di ligando
• Il legame deve essere saturabile a determinate concentrazioni di ligando
• Il recettore deve essere selettivo per molecole biologicamente attive

La cinetica di reazione ha una prima fase di curva quasi come una retta, poi diminuisce fino ad arrivare a saturazione con un asintoto. Il legame avviene quando il ligando e il recettore collidono per diffusione, con il corretto orientamento e sufficiente energia.

K = costante cinetica di associazione
onK =costante cinetica di dissociazione
offLa velocità di associazione è pari al numero di eventi di legame per unità di tempo=[ligando]*[recettore]*K.
onIl recettore e il ligando rimangono legati per un periodo di tempo casuale e la probabilità di dissociazione è la stessa in ogni istante.
La velocità di dissociazione è= [ligando]*[recettore]*K off

L’equilibrio sarà raggiunto quando la velocità di formazione di nuovi complessi ligando-recettore uguaglierà la velocità di dissociazione e quindi:

[recettore]Se si pone [ligando]=Kd si avrà = 1[ligando-recettore]La Kd è quindi la concentrazione di ligando alla quale metà dei siti di legame del recettore sono occupati. Questa costante dovrebbe essere simile alla concentrazione di ligando che è attiva in vivo per poter funzionare bene quindi per l’identificazione di un recettore si può confrontare la Kd e la concentrazione di ligando osservabile che permette la funzione.

L’equazione può essere linearizzata: Sperimentalmente però è difficile trovare il 100% di saturazione perché il ligando effettua un legame specifico saturabile ma anche un legame aspecifico che non è saturabile: sommando i due possibili legami si avrà una crescita continua. Per determinare quindi il legame specifico si effettua un esperimento di reversibilità del legame: in una matrice si hanno recettori a cui si legano specificamente e non, dei ligandi radioattivi. Dopodiché viene aggiunta una grossa concentrazione di ligando non radioattivo che fa da antagonista sul legame specifico diminuendo la radioattività, mentre il legame non specifico non spiazza le molecole radioattive già legate. Nel primo esperimento riesco a calcolare il binding totale mentre nel secondo riesco a calcolare il binding aspecifico: il binding specifico sarà quindi la differenza di questi due valori.

Il secondo messaggero

Il secondo messaggero è una molecola diffusibile adibita a convogliare un’informazione da una sorgente extracellulare ad un bersaglio all’interno della cellula. Il Ca2+ è il principale secondo messaggero nelle piante grazie al fatto che la sua concentrazione interna è molto più bassa rispetto a quella esterna. I segnali quindi possono aumentare in modo transiente rispetto al calcio citosolico per avere una risposta dall’organismo. Anche i fosfolipidi sono una fonte di secondi messaggeri insieme a molte altre molecole.

Arabidopsis thaliana

L’origine di Arabidopsis thaliana è europea, anche se ormai è distribuita in Europa, Asia e Nord-America. È stata scoperta da Johannes Thal nel sedicesimo secolo e proposta come pianta modello nel 1943. Ha infatti una serie di caratteristiche tali per essere stata sfruttata come sistema modello vegetale:

• Genoma piccolo, ossia ci sono poche regioni non codificanti, ed è suddiviso in 5 cromosomi. Una minore concentrazione genica è presente solo a livelli del centromero, per il resto la densità è uniforme su tutti i cromosomi. Il contenuto aploide è di 125 Mb.
• Rapido ciclo vitale, in 6 settimane si passa da seme a seme;
• Piccole dimensioni: facile coltivazione in spazi ristretti, infatti una pianta cresce in 1cm²
• Da una pianta si possono ottenere più di 5000 semi
• Disponibilità di mappe genetiche: Progetto AGI che è l’iniziativa di sequenziamento di Arabidopsis con inizio del progetto nel 1996 e completamento nel 2000.

Tramite il sequenziamento è stato possibile fornire indicazioni sulla storia evolutiva: c’è stata una duplicazione dell’intero genoma, una successiva perdita di geni e un trasferimento di alcuni geni da un cianobatterio ancestore dei plastidi. Il 54% dei geni può essere assegnato a una determinata categoria funzionale sulla base della similarità con proteine e motivi noti di altre specie.

La possibilità di poter trasferire le informazioni raccolte dal sistema modello su piante di interesse agronomico. Ad esempio i geni di riso e di Arabidopsis hanno una struttura simile e si hanno identità di sequenza su proteine di entrambe le specie.

Altre caratteristiche

• È una brassicacea e come tale presenta una forma a rosetta nel periodo vegetativo e uno stelo fiorale con infiorescenza nel periodo riproduttivo.
• Molti studi vengono effettuati sui germogli che sono molto piccoli
• Il fiore è costituito da 4 petali, 4 sepali e 6 stami (2 corti e 4 lunghi)
• Va incontro ad autofertilizzazione ma è possibile in laboratorio effettuare cross-fertilizzazione applicando il polline sulla superficie dello stigma
• Il frutto si chiama silique, può contenere a maturità, ossia dopo due settimane dalla fertilizzazione, 30-60 semi. I semi infatti sono lunghi poche centinaia di μm e pesa 20 μg.

Genomica funzionale

Lo studio della genetica può essere effettuato in modo forward oppure reverse: nella genetica forward si parte da una pianta con fenotipo alterato e si va a studiare il suo genoma tramite mappatura del genoma (chromosome walking e chromosome landing) per arrivare all’identificazione del gene mutato e l’ipotesi di funzione (funziona meglio per mutazioni gain of function rispetto a quelle loss of function); mentre nella genetica reverse invece parto dal gene che già conosco e di cui produco un suo knockout (mutazione specifica del gene) e analizzo il fenotipo dato da questa mutazione.

Mutagenesi

La mutagenesi può essere:

• Fisica, tramite trattamento con raggi UV o X ma anche radiazioni α, β, γ
• Chimica, tramite trattamento con composti chimici come la caffeina, la nicotina e l’acido etilmetansulfonico (EMS), il più utilizzato. L’EMS alchila la guanina formando la O-6-etilguanina. Di conseguenza la DNApol inserisce una T invece che una C.

La mutagenesi si può effettuare:

1. Sui semi, in particolare su semi maturi con gli embrioni completamente sviluppati e in grado di germinare. Se le mutazioni si formano a carico di una qualunque cellula questa produce una linea clonale di cellule mutate, che dopo il successivo sviluppo post-embrionale porta allo sviluppo di piante eterozigoti con settori mutanti. Queste però non sono mutazioni molto interessanti perché non sono avvenute sulla linea germinale. Solo se i settori mutati includono lo strato L2 del meristema apicale, da cui sarà generata la linea germinale della pianta matura, la mutazione passerà alla successiva progenie. I fiori mutanti produrranno il 25% di semi omozigoti riconoscibili per il loro fenotipo aberrante.
2. Tramite inserzione che permette una mutazione di un gene inserendo un frammento di DNA possibile tramite:

• T-DNA di Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens è un batterio che attacca le piante producendo dei tumori noti come galla a corona. I tumori sono prodotti da un de-differenziamento e ad una eccessiva divisione cellulare a causa della diversa regolazione del rapporto auxina-citochinine che regola la morfogenesi.

Facendo un esperimento in coltura si nota infatti come ci siano diverse possibilità rispetto a questo rapporto:

• No divisione cellulare
• Formazione radici
• Sviluppo callo indifferenziato
• Formazione germogli

I geni di virulenza del batterio sono attivati dall’acetosiringone, un prodotto della cellula che viene sintetizzato quando ci sono lesioni a livello della parete cellulare. Questi geni sono contenuti in un plasmide noto come Ti che contiene anche il T-DNA. I geni vir portano al taglio del T-DNA formando un intermedio a singolo DNA che viene inserito nella cellula ospite, portato nel nucleo e integrato nel genoma della pianta. Questa integrazione induce la sintesi di auxina, di citochinine e opine, amminoacidi modificati utilizzati da Agrobacterium ma non dalla pianta. Questi amminoacidi derivano dall’arginina a cui si legano altre molecole come l’α-cheto-glutarato per la sintesi di nopalina o il piruvato per la sintesi di octopina. Sono stati effettuati esperimenti di silenziamento di geni del T-DNA per poter comprenderne la funzione: la mutazione tms si ha nel locus dei geni per la sintesi di auxina; la mutazione tmr per i geni per la biosintesi di citochinine; tml per i geni per la crescita tumorale.