Biologia molecolare - Appunti completi

LA REAZIONE CATALIZZATA DALLA DNA POLIMERASI

Abbiamo detto che la DNA polimerasi catalizza la formazione del legame fosfodiestere tra i nucleotidi e quindi

la formazione della catena polinucleotidica. La DNA polimerasi ha bisogno di uno stampo e lavora sempre in

direzione 5’→3’; quindi questo vuol dire che legge lo stampo in direzione 3’→5’ perché i due filamenti di DNA

devono essere sempre antiparalleli.

Il nucleotide che la DNA polimerasi inserisce nel filamento neosintetizzato sarà scelto sulla base del nucleotide

complementare a quello presente nello stampo.

L’OH in 3’ del DNA replicato funzionerà da

nucleofilo nei confronti del nucleotide o

nucleoside trifosfato (ppp) che deve entrare.

Il nucleoside trifosfato che deve entrare viene

scelto sulla base della base azotata nel

nucleotide che è presente sullo stampo. Se

sullo stampo è presente una timina, il

nucleotide che viene inserito contiene

un’adenina.

Si ha quindi la formazione del ponte

fosfodiestere con inserimento del nuovo 56

nucleotide e l’eliminazione di un pirofosfato (PPi). Il pirofosfato poi verrà idrolizzato dalla Pirofosfatasi

inorganica (enzima ubiquitario).

L’idrolisi del pirofosfato è importante perché dà la spinta termodinamica per fare in modo che l’inserimento

→

della base sia irreversibile rende il processo esoergonico per due motivi:

- motivo termodinamico: il pirofosfato è un composto ad alta energia e quindi se lo idrolizziamo liberiamo

energia e l’energia liberata si somma all’energia della reazione

- motivo dell’equilibrio chimico: il pirofosfato è un prodotto di questa reazione e se portiamo via un prodotto

la reazione viene spinta a completamento.

LA REPLICAZIONE È SEMIDISCONTINUA

La replicazione è semidiscontinua perché i filamenti del DNA di origine sono antiparalleli. Nella forcella di

replicazione entra una DNA polimerasi e questa DNA polimerasi deve duplicare entrambi i filamenti però è in

grado di duplicare in maniera continua solamente uno dei due filamenti, ovvero quello che ha la polarità

3’→5’ può essere duplicato in maniera continua. L’altro filamento con polarità opposta 5’→3’ deve essere

duplicato in modo discontinuo, infatti viene duplicato a frammenti che prendono il nome di FRAMMENTI DI

OKAZAKI. Per questo uno dei due filamenti del DNA viene indicato come filamento giuda o filamento veloce

ed è quello che viene duplicato in maniera continua mentre l’altro filamento viene indicato come filamento

ritardato o filamento lento.

Abbiamo detto che il processo di duplicazione richiede il primer. Il primer lo abbiamo definito come un

oligonucleotide complementare ai siti di inizio della replicazione. Aggiungiamo ora che il primer è un

oligonucleotide a RNA. Non è DNA perché la DNA polimerasi non è in grado di iniziare una catena

polinucleotidica mentre l’RNA polimerasi sì. L’RNA

polimerasi ha due siti per i primi due nucleotidi.

→ Per poter iniziare una catena dentro all’enzima

devono poter entrare il nucleotide numero 1 ed il

nucleotide numero 2 allora l’enzima catalizza la

formazione del primo ponte fosfodiestere;

dopodiché si aggiunge il terzo, il quarto, il quinto…

non ci sono più problemi.

L’RNA polimerasi ha un sito nel quale può entrare

un solo nucleotide per volta, quindi l’unica cosa che

può fare è attaccare quel nucleotide all’innesco. In

realtà non è un vero e proprio innesco quello della

RNA polimerasi ma è solamente la possibilità di

legare contemporaneamente due nucleotidi nel

sito attivo: il primo nucleotide ed il secondo.

LA REPLICAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI

La DNA polimerasi possiede attività esonucleasica 3’→5’ e, nel caso della Pol I, attività esonucleasica 5’→3’.

L’attività esonucleasica è un’attività di idrolisi del legame fosfodiestere e viene indicata anche come attività di

correzione di bozze. L’attività esonucleasica serve a togliere l’ultimo nucleotide inserito se per caso è stato

inserito un nucleotide sbagliato. Questa attività conferisce alla Pol I delle caratteristiche particolari che

permettono a questa polimerasi di eliminare i primer dalla molecola del DNA. 57

La replicazione del DNA necessita di enzimi aggiuntivi per separare i filamenti del DNA, svolgere l’elica, legare

il DNA a singolo filamento e sintetizzare gli inneschi di RNA.

Una pinza di scorrimento si aggancia allo stampo di DNA per aumentare la processività della DNA polimerasi.

La DNA polimerasi è in grado di duplicare il DNA perché resta associata allo stampo: finché rimane associata

allo stampo è in grado di duplicare il DNA. Se si dissocia dallo stampo non è più in grado di duplicare il DNA.

Quindi è importante che la DNA polimerasi resti associata allo stampo per un tempo sufficiente per assicurare

→

la replicazione questo prende il nome di processività della DNA polimerasi. La processività viene

aumentata dalla presenza di una pinza di scorrimento che in pratica mantiene la DNA polimerasi sul filamento

stampo del DNA. Questa pinza non può bloccare l’enzima.

La DNA polimerasi necessita sempre di un primer. Il filamento veloce ha un solo primer mentre sul filamento

lento, ogni volta che la DNA polimerasi comincia un frammento nuovo, ha bisogno di un primer nuovo. Quindi

→

sul filamento lento ci sono molti primer un primer per ciascun frammento di Okazaki.

I primer sono a RNA ma al termine della duplicazione la molecola di DNA deve contenere solo DNA e quindi

bisogna eliminare i primer. Se però eliminiamo i primer tra un frammento di Okazaki e l’altro resta

→

un’interruzione. Quindi occorre un altro enzima in grado di chiudere l’interruzione DNA ligasi.

→

Fattori= proteine che si associano al DNA ci sono dei fattori di iniziazione della duplicazione ma ci sono

anche dei fattori di terminazione della duplicazione. Abbiamo bisogno anche di topoisomerasi perché quando

apriamo la doppia elica del DNA a valle rispetto all’apertura generiamo un superavvolgimento. Il

→

superavvolgimento generato dall’apertura si oppone all’apertura se non rilassiamo il DNA non riusciamo

più a duplicarlo. Le topoisomerasi servono a rilassare il DNA superavvolto a valle rispetto alla direzione della

duplicazione.

→ La replicazione completa del DNA richiede la presenza della DNA ligasi, di un fattore di terminazione e

della topoisomerasi.

I livelli bilanciati dei nucleotidi, il meccanismo della polimerasi, la sua attività come correttore di bozze, e le

attività degli enzimi di riparazione del DNA contribuiscono all’accuratezza della replicazione del DNA.

La DNA polimerasi è una sola ed ha un sito attivo che riconosce i nucleotidi, ma i nucleotidi sono 4. Quindi lo

stesso sito attivo deve riconoscere 4 nucleotidi diversi e deve attaccarli nel modo giusto sul filamento

nascente in modo che sia attaccato il nucleotide complementare allo stampo. Quindi deve poter riconoscere il

nucleotide giusto ed attaccarlo. La DNA polimerasi può fare degli errori ed il sito di correzione di bozze serve

anche a correggere l’eventuale aggiunta di un nucleotide sbagliato. Nonostante questo, l’errore è sempre

possibile e ci saranno degli altri sistemi di riparazione del DNA che intervengono successivamente alla

replicazione. Durante la replicazione possiamo avere solo la correzione di bozze.

Dalla tabella possiamo vedere che ci sono molte meno molecole della Pol III rispetto alla Pol I anche se è più

importante. Non c’è bisogno di tanta DNA Pol III perché è molto processiva. La processività è il tempo che la

DNA polimerasi rimane associata al DNA per la duplicazione. La Pol III ha un’elevata processività, molto più

elevata rispetto alle altre polimerasi (le altre polimerasi si dissociano più frequentemente dallo stampo).

Della Pol I sono necessarie più copie perché ci sono tanti frammenti di Okazaki e se li vogliamo togliere in

fretta abbiamo bisogno che più enzimi attacchino i primer dei vari frammenti di Okazaki.

La Pol III è inoltre più veloce rispetto alle altre polimerasi.

→ →

[+ è presente; - non è presente]

La DNA-Pol I oltre al sito esonucleasico 3’→5’ possiede anche una attività esonucleasica 5’→3’ (attività di Nick

traslation o di spostamento dell’incisione). 58

Il filamento rosso (3’ a sx) è il filamento stampo; il filamento

azzurro (5’ a sx) è il filamento sintetizzato. In questa immagine è

stato introdotto un nucleotide sbagliato perché sul filamento

azzurro c’è una timina quando invece ci dovrebbe essere una

citosina visto che sul filamento stampo c’è una guanina. L’ultimo

nucleotide inserito (si capisce che è l’ultimo inserito perché c’è

OH in 3’ libero) dalla DNA polimerasi è una timina difronte una

→

guanina non va bene. In questi casi succede che nel sito attivo

dell’enzima l’interazione guanina-timina non è perfetta quindi

questo provoca una distorsione nell’elica del DNA. Questa distorsione impedisce all’enzima di continuare la

polimerizzazione: rallenta la velocità di polimerizzazione dell’enzima. Rallentando la velocità di

polimerizzazione dell’enzima, l’estremità 3’ del filamento neosintetizzato si può spostare dal sito di

polimerizzazione al sito esonucleasico 3’→5’.

I nucleotidi che vengono inseriti devono essere complementari ai nucleotidi presenti sullo stampo: se sono

complementari la doppia elica che si forma è una doppia elica normale che è compatibile con il sito attivo

→non ci sono problemi e la DNA polimerasi continua a duplicare. Se invece il nucleotide che viene inserito è

un nucleotide sbagliato, la doppia elica viene distorta e, nel sito attivo, non fa tutte le interazioni che

→

dovrebbe fare per mantenere il substrato legato al sito attivo allora la polimerasi non riesce ad andare

avanti. La polimerasi rallenta ma quello che è importante è che il filamento neosintetizzato ha il tempo di

passare dal sito polimerasico al sito esonucleasico. Se la polimerasi scorre velocemente il filamento non ci

passa mai dal sito esonucleasico, se invece rallenta il filamento neosintetizzato entra nel sito esonucleasico

3’→5’ che è il sito di correzione di bozze. →

Il sito di corr