Biochimica e biologia molecolare delle piante

ARABIDOPSIS THALIANA

Essa è considerata la pianta modello per eccellenza, proposta da

Thal durante la seconda guerra mondiale e divenuta unico sistema

modello nel 1970. È distribuita in tutti i continenti e cresce in

Europa, Nord-America, e Asia. È una pianta a rosetta e quindi le

foglie si sviluppano a raggiera intorno allo stelo. Il suo ciclo vitale è

relativamente veloce e dalla nascita del germoglio passa circa un

mese/mese e mezzo per formare il suo apparato riproduttivo che

consta di uno stelo fiorale dal quale diramano numerose

infiorescenze e dopo circa 2 mesi si formano i frutti che vengono

chiamati silique e hanno una forma allungata (ospitano dai 30 ai 40

semi che pesano 20 microg quindi sono molto

piccoli, vantaggioso se si vuole far crescere molte

piante in uno spazio ridotto). Il fiore è molto piccolo

e consta di 4 sepali, 4 petali e 6 stami (2 corti e 4

lunghi). La caratteristica fondamentale che l’ha

resa un ottimo modello sta nel fatto che ha

capacità di AUTOFERTILIZZARSI. Questa

peculiarità garantisce una stabilità genica fra una

generazione e l’altra. Poi ovviamente in laboratorio

è possibile fare anche cross-fertilizzazioni

semplicemente strofinando il polline sullo stigma

dell’altra piantina che si vuole incrociare. In sunto,

le caratteristiche che hanno reso Arabidopsis

una pianta modello sono:

1. GENOMA PICCOLO (distribuito in 5 cromosomi con 125 Mb con pochissime

sequenze non codificanti e un numero di basi ridotto, in questo senso “piccolo”).

Ossia con alta densità di geni codificanti e distribuiti pressoché uniformemente.

2. RAPIDO CICLO VITALE (circa 6 settimane da seme a seme)

3. PICCOLE DIMENSIONE facilmente coltivabile in spazi ristretti (10000 semi

possono germogliare su una piastra Petri, molto utile quando si devono fare degli

screening sui germogli). Si pensi che da una pianta si possono ottenere oltre

5000 semi, quindi facilmente mappabile geneticamente.

Esistono diversi ecotipi che fanno sì che le tempistiche del ciclo vitale cambino

leggermente, poi anche le condizioni ambientali hanno la loro influenza ma

pressoché le tempistiche non cambiano molto, il ciclo vitale è sempre molto veloce.

Si pensi che già dopo il primo giorno il seme germoglia e dopo 30 giorni già inizia a

sviluppare lo stelo fioraie! Essendo queste molto piccole, in un laboratorio è

possibile far crescere migliaia di piantine. Nel 2000 dopo solo 4 anni (pochi per

l’epoca) è stato sequenziato tutto il genoma di Arabidopsis che ha poco più 25500

geni. Questo è stato fondamentale per poter studiare la funzionalità genetica di un

gene. Qui sotto sono riportati i 5 cromosomi della pianta. La densità genica, come

si vede dall’immagine, è ben uniformemente distribuito con poche zone a bassa

densità genetica. Inoltre è possibile notare nel genoma che, esistendo delle regioni

fortemente simili in cromosomi diversi, in un passato ancestrale sembrerebbe che il

genoma di arabidopsis si è duplicato. Molti geni sono stati perduti per questo non vi

è una duplicazione perfetta. Un’altra cosa che è emersa dagli studi di genetica

evolutiva è che ci sono geni tipici di cianobatteri ancestrali (teoria endosimbiontica)

o comunque di primitivi organismi fotosintetici.

Per poter associare una funzione ad un determinato ormone o anche alla luce

stessa, bisogna riuscire a creare un saggio che dimostri un’ipotesi associata ad il

gene di interesse. In questo Arabidopsis diviene fondamentale, in quanto, un

iniziale supposizione la si può fare semplicemente andando a fare l’analisi della

sequenza nucleotidica. In pratica riuscire a sequenziare e studiare bene

Arabidopsis permette di fare buona parte del lavoro per un’altra specie che

presenta un’omologo di un gene presente nel modello. Si fa una cosiddetta analisi

di similarità genica o amminoacidica qualora fosse una proteina. Questo è alla

base del concetto del sistema modello. Ossia si possono fare degli studi su di essa

e i risultati ottenuti possono poi essere traslati su altri organismi.

Oggigiorno però, in contrasto con quello detto prima, esistono tutta una serie di

macchinari (molto costosi) che sono capaci di fare in pochi giorni quello che nel

2000 si faceva in anni. Questi macchinari prendono il nome di NGS (next

generation sequencing). Non si usano più come prima gli organismi modello per

poter studiare i geni degli altri in quanto questi macchinari hanno permesso di

sequenziare interi organismi in maniera molto semplice. Nonostante ciò resta

comunque importante la presenza di un organismo modello proprio perché è

possibile farlo crescere in condizioni sperimentali controllabili.

Risulta quindi essenziale dover utilizzare e Arabidopsis intesa come un modello per

riuscire a comprendere le funzioni dei geni nelle piante.

Ci sono due approcci sperimentali di genetica funzionale che vengono usati e sono

la FORWARD GENETICS e la REVERSE GENETICS.

Nel primo caso il punto di partenza è una pianta con un fenotipo alterato e da li si

cerca di capire il gene che ha subito la mutazione e attraverso una mappatura

genetica confrontandola col fenotipo selvatico (ormai tutti i genomi sono stati

sequenziati) si cerca poi di trovare un ipotesi funzionale. Le tecniche di mappatura

genetica sono molto complesse ma sostanzialmente possono essere due:

cromosoma walking e cromosoma landing, la prima come dice il nome si

“cammina” sul cromosoma fino a quando non si trova la mutazione in questione

mentre nel landing c’è un’identificazione un po’ più mirata.

Nel secondo caso, più moderno, al contrario si parte dal gene e si arriva al fenotipo.

In sostanza si fa un’analisi reverse partendo dal gene mutato (voluto dal

ricercatore) per poter analizzare poi il fenotipo alterato.

Entrambe le tecniche, però, hanno in comune il fatto che si basano su un ANALISI

DI MUTANTI. Queste avvengono anche spontaneamente in natura o in laboratorio

ma la frequenza di mutazioni spontanee è bassa. Di conseguenza bisogna

aumentarla e ci sono diversi modi con cui si può fare:

AGENTI MUTAGENI

- FISICI: UV, raggi X, e le varie radiazioni ionizzanti.

- CHIMICI: che attualmente sono i preferiti, inizialmente venivano usati alcuni

alcaloidi come la caffeina e la nicotina che però hanno una capacità

mutagena molto limitata. Col tempo sono stati messi appunto dei mutageni

più efficienti come l’EMS (esteri dell’acido etilmetansulfurico) che è un

agente alchilante (introdurre un gruppo alchile come metile o etile) della

guanina. Questa mutazione porta alla DNA polimerasi ad aggiungere una

citosina invece di una T. Questi agenti di solito vengono utilizzati

sui semi che devono essere

completamente maturi.

Come si vede dall’immagine sotto che

schematizza un embrione di un

arabidopsis il seme è formato da tutta una serie di punti all’interno dell’embrione

che poi nell’adulta daranno origine a un tessuto ben preciso. Importanti il

meristema apicale del germoglio (al punto di incrocio dei cotiledoni) e anche il

meristema apicale della radice. Il trattamento di questi con EMS porterà in maniere

del tutto casuale alle cellule di migliaia di semi a mutare in diversi punti del

genoma. È molto importante il punto dove il seme riceve la mutazione perché

qualora dovesse essere nel punto rosso, significa che poi la mutazione

sicuramente passerà alla prole mentre negli altri punti rosa, la mutazione rimane

alla piantina madre (L2 che è lo strato del meristema da cui deriva la line

gerimanale successiva segnata in rosso). Per riconoscere poi che questa

mutazione SIA avvenuta, il modo più semplice è facendo un’analisi del fenotipo

della generazione successiva. MUTAGENESI PER INSERZIONE o

TAGGING

Questo approccio si basa sull’inserzione di una

porzione di DNA all’interno del genoma della

pianta e in questo modo si avrà una buona

probabilità di alterare la funzione del gene dove

questo si è inserito.

Ci sono due tecniche principali che vengono

utilizzate e sono:

T-DNA: che è una porzione plasmidica di DNA di

8 cromosomi contenuta all’interno di un batterio

(agrobatterium). In natura è capace di far nascere

un‘escrescenza tumorale (canker) come

l’immagine qui sotto riportata. In laboratorio quest’infezione, o queste escrescenze

possono dare origine a nuovi tessuti cellulari esponendole a auxina:citochina in

rapporto 4:1 a dimostrazione di quel che succede nella pianta quando il batterio

infetta la pianta (aumenta la concentrazione di citochinine nella cellula). Fu

importante questa scoperta per poter evincere quanto sia importante il rapporto di

questi ormoni nella morfogenesi.

A) no divisione cellulare

B) Formazioni di radici

C) Sviluppo indifferenziato

D) Formazioni di germogli

Il funzionamento del microrganismo riconducibili all’aumento dell’auxina e delle

citochinine è qui sotto schematizzato:

La sua infezione parte da uno stress meccanico della pianta (danneggiata) che può

venire dal vento o da un insetto/animale. Come mostra l’immagine, allo stress

meccanico, la cellula risponde secernendo “acetilsirigone” che attiva il processo

di virulenza del batterio. Quest’ultima possiede un plasmide (plasmide Ti) che

possiede due parti importanti, la regione del T-DNA e poi la regione Vir. La prima

è la parte del DNA che viene trasmesso (sotto forma di singolo filamento) e l’altra è

la regione che contiene le informazioni per permettere al T-DNA di infettare il DNA

della cellula vegetale. Una volta che il T-DNA si è ricombinato i geni del plasmide

iniziano ad essere espressi (aumenta la [auxina] e la [citochinine]) che porta alla

formazione del canker. Questa è una strategia del batterio perché il suo intento è

quello di far produrre particolari aa che si chiamano opine che sono fonte di N e C

(energia), queste sono due (opalina e octopina) e derivano dall’arginina. La

strategia dei ricercatori, invece, è quella di sfruttare questo sistema per INDURRE

MUTAZIONI. I geni Vir iniziano

tutto il processo.

Sono sei geni (A-E),

ognuno sintetizza

per una proteina

che ha una

funziona che

interviene nel

processo. Il gene A

è costitutivo,

sintetizza per il

recettore

dell’acetilsirigone.

Gli altri vengono

espressi solo in

presenza del

segnale. In

particolare G attiva

la trascrizione di tutti gli altri geni, anch’esso è costitutivo ed è attivato da A che è

attivato dall’acetils