Biologia molecolare - Appunti completi

DNA:

Questi enzimi sono della famiglia delle topoisomerasi/girasi. Le diverse strutture possibili sono dette topoisomeri della molecola di DNA completamente rilassata (ovvero DNA informa B con circa 10/12 coppie di basi per giro d’elica).

Il superavvolgimento è dovuto a un avvolgimento della molecola di DNA su se stessa.

L’avvolgimento può essere nella stessa direzione dell’avvolgimento della doppia elica o in direzione opposta.

• Nel primo caso abbiamo un superavvolgimento positivo e il DNA è superspiralizzato (aumento tensione)
• Nel secondo caso abbiamo un superavvolgimento negativo e il DNA è sottospiralizzato.

Biochimica e biologia molecolare: Acidi nucleici

Di fatto il DNA non è mai nello stato completamente rilassato, ma c’è sempre una sua quota di DNA super o sottospiralizzato.

Si può definire una densità di superelica, ovvero il numero di giri di superelica per giro di doppia elica (ad

esempio unDNA con 100 coppie di basi avrà 10 giri d'elica. Di fatto un DNA rilassato di 100 coppie di basi avrà solo i giri della doppiaelica e siccome ci sono 10 coppie di basi per ogni giro di doppia elica, avrà 10 giri di doppia elica.

• σ = densità di superelica.
• τ = n° di giri di superelica, cioè quante volte l'elica (ad esempio di 10 giri) si avvolge su sé stessa.
• β = n° di giri di doppia elica.

Il numero di legame (L o Lk) del DNA ci dice quante volte la molecola di DNA si avvolge su sé stessa quando abbiamo una doppia elica chiusa.

Indica quindi quanto superavvolgimento è presente.

L è composto da due parametri: l'avvolgimento (Twist, W) e il superavvolgimento (Writhe, W).

L = T + W

T = numero totale di giri d'elica. È determinato dal n° di coppie di basi per giro: per un DNA completamente rilassato con 200 coppie di basi in struttura

B (10 coppie di basi per giro) T = 200/10 = 20• W = indica quante volte il DNA si avvolge su sé stesso (rivoluzioni dell'asse duplex nello spazio). Se il DNA è completamente rilassato W=0.• Il n° di legame (L) è una proprietà invariante di ogni molecola chiusa di DNA (se aumenta T deve diminuire W e viceversa): non può cambiare a meno che non si abbia una rottura e una riunione dei filamenti ad opera di enzimi (girasi). Inoltre un DNA aperto non ha numero di legame perché può ruotare completamente. Un DNA completamente rilassato ha solo le caratteristiche della doppia elica. Questa può subire superavvolgimenti positivi o negativi.• Per cambiare il numero di legame per prima cosa bisogna aprire l'elica di DNA, ma questo comporta l'eliminazione di giri d'elica. Se togliamo un giro d'elica bisogna compensare aggiungendo un superavvolgimento in quanto il numero di legame deve rimanere costante.

Questo permette di compattare il DNA e tenerlo in uno stato energizzato. Abbiamo quindi l'apertura del DNA, il cambio di giri d'elica e il cambio di superavvolgimento (forza che si oppone all'apertura della doppia elica). Come si può quindi aprire tutta l'elica del DNA (ad esempio per poter fare la duplicazione)?

Si può aprire tramite la famiglia degli enzimi topoisomerasi, distinte in tipo I e tipo II, che tagliano il filamento in modi diversi. Tagliare il filamento vuol dire rompere il legame fosfodiestere che tiene unita la sequenza zucchero-fosfato della molecola di DNA. È giusto specificare quindi che:

• Tagliare il DNA vuol dire interagire con lo scheletro zucchero-fosfato.
• Aprire la molecola di DNA vuol dire interferire con i ponti H che tengono unite le coppie di basi.

Biochimica e biologia molecolare: Acidi nucleici. La denaturazione infatti agisce sui legami a idrogeno delle coppie di basi, ma lo scheletro rimane lo stesso, mentre

Le topoisomerasi tagliano il legame fosfodiesterico.

• La topoisomerasi di tipo I taglia il legame fosfodiestere di un solo filamento. Quando si taglia un filamento, l'altro fa da perno, la molecola del DNA ruota sul filamento intero e poi la topoisomerasi ricatalizza l'unione dei filamenti.
• La topoisomerasi di tipo II taglia il legame fosfodiestere di due filamenti: taglia tutti e due i filamenti, fa passare una parte di DNA sull'altra (tolgono un superavvolgimento e ne introducono un altro). Quindi in presenza delle topoisomerasi il DNA da superavvolto può diventare completamente rilassato. Tagliare lo scheletro zucchero-fosfato vuol dire liberare entrambe le estremità del DNA (serve per introdurre o eliminare giri di super elica).

Le estremità sono mantenute dall'enzima, che introduce o elimina un avvolgimento e poi riunisce le due estremità. Se non si fossero le topoisomerasi a un certo punto sarebbe impossibile continuare.

ad aprire la doppia elica del DNA perché la forza esercitata per l'apertura diventa uguale a quella esercitata dal superavvolgimento e la molecola non si apre più. Superavvolgimenti positivi e negativi: - Prendiamo ad esempio una molecola di DNA circolare e consideriamo quello che succede se ruotiamo la molecola nella direzione opposta rispetto a quella della doppia elica prima di unire le estremità: la molecola tenderà a disavvolgersi. - In un DNA parzialmente disavvolto il numero di basi per giro d'elica aumenta e poiché la forma stabile del DNA è quella con 10 coppie di basi per giro d'elica la molecola tenderà ad opporsi al disavvolgimento avvolgendosi su sé stessa, cioè assumendo una conformazione superavvolta. - Il DNA parzialmente disavvolto genera un superavvolgimento negativo (il DNA circolare normalmente presenta un superavvolgimento negativo quindi è questo quello che succede in natura). - Se

Facciamo la stessa cosa, ma ruotando la molecola nella direzione a favore della doppia elica, la molecola tenderà invece ad avvolgersi. In questo caso, in un DNA parzialmente avvolto il numero di basi per giro d'elica aumenta e poiché la forma stabile del DNA è quella con 10 coppie di basi per giro d'elica la molecola tenderà ad opporsi all'avvolgimento avvolgendosi su sé stessa cioè assumendo una conformazione superavvolta.

Il DNA parzialmente avvolto genera un superavvolgimento positivo. Biochimica e biologia molecolare: Acidi nucleici

Il superavvolgimento non è limitato al DNA circolare ma lo si può osservare anche nei DNA lineari (eucarioti), in cui il DNA è compattato sulle proteine istoniche che bloccano le estremità del DNA.

Il superavvolgimento negativo gioca un ruolo importante nel processo di compattamento del DNA nei cromosomi.

Inoltre, poiché il superavvolgimento negativo è

caratteristico del DNA parzialmente disavvolto, esso esercita una forza che aiuta il processo di separazione dei due filamenti del DNA necessario per la replicazione (sintesi del DNA) e la trascrizione (sintesi dell'RNA). Un DNA troppo superavvolto è troppo instabile e si apre troppo facilmente. Questo non va bene perché i processi che deve subire, come la duplicazione, devono essere regolati. Famiglia delle topoisomerasi La topoisomerasi di tipo I non richiede l'utilizzo di ATP mentre la topoisomerasi di tipo II sì. - Topoisomerasi di tipo I Consideriamo il sito attivo della topoisomerasi di tipo I: l'amminoacido che porta avanti la catalisi è un residuo di tirosina, che fa un attacco nucleofilo sul fosfato del ponte fosfodiesterico. - La tirosina "attiva" della topoisomerasi fa un attacco nucleofilo al gruppo fosfato delloscheletro del DNA con il suo gruppo OH, formando un legame covalente tra l'enzima e il DNA. - La reazioneinversa di rilegazione è prodottada un attacco nucleofilo del gruppo OHdell'estremità del DNA libera che rilega ilfosfato, formando di nuovo la doppia elica eliberando l'enzima.Tutto questo può avvenire con il cambioconformazionale dell'enzima, che va a riunirele estremità dall'altra parte dell'altro filamento.In seguito, il meccanismo di azione delle topoisomerasi di tipo IA procariotica:Biochimica e biologia molecolare: Acidi nucleici - Topoisomerasi di tipo II Le topoisomerasi di tipo II sono enzimi formati da più subunità. In particolare, sono presenti: - 2 subunità ATPasiche. - 2 subunità che formano il core della proteina. Queste topoisomerasi, diversamente dalle topoisomerasi di tipo I, tagliano l'elica sia sopra che sotto. Questi processi avvengono anche nei cromosomi lineari. - Tutte le volte che il DNA è aperto e libero non si parla di numero di legame. Possiamo

Superavvolgimenti del DNA

I superavvolgimenti del DNA si verificano solo se entrambe le estremità del DNA sono bloccate.

La trascrizione può generare superavvolgimenti positivi del DNA davanti alla polimerasi e negativi dietro.

Inibitori delle topoisomerasi

Gli inibitori delle topoisomerasi possono essere utilizzati come antibiotici e antitumorali. Alcuni esempi includono:

• L'attività delle topoisomerasi diventa più importante quando aumenta il grado di superavvolgimento del DNA. Questo accade durante la duplicazione del DNA stesso, che comporta l'apertura della doppia elica.
• Un enzima (es. DNA polimerasi) per duplicare il DNA deve prima aprirlo, generando superavvolgimenti.
• I superavvolgimenti si oppongono all'apertura, quindi le topoisomerasi sono importanti per rilassare il superavvolgimento e permettere alla polimerasi di duplicare tutto il DNA.

Il DNA viene duplicato ad esempio durante la mitosi, ovvero quando le cellule si dividono.

si sono formati). Durante la divisione cellulare, i cromosomi sono visibili al microscopio come strutture ben definite e condensate. Il compattamento del DNA nei cromosomi avviene attraverso una serie di livelli di organizzazione. Il primo livello è dato dal DNA stesso, che si avvolge attorno a proteine chiamate istoni. Questa struttura è chiamata nucleosoma. I nucleosomi si aggregano formando una struttura a forma di perline chiamata cromatina. La cromatina subisce ulteriori livelli di compattamento. Si forma una struttura a forma di spirale chiamata solenoide, che a sua volta si avvolge su se stessa formando una struttura più compatta chiamata cromosoma. Il compattamento del DNA nei cromosomi è fondamentale per garantire la stabilità del genoma e per permettere la corretta divisione cellulare. Inoltre, il compattamento del DNA influisce sulla regolazione dell'espressione genica, poiché l'accesso ai geni è limitato quando il DNA è fortemente condensato nei cromosomi. La comprensione dei meccanismi di compattamento del DNA nei cromosomi è di grande importanza per la comprensione dei processi biologici fondamentali e per lo sviluppo di terapie mirate contro malattie come il cancro, in cui la proliferazione cellulare è alterata.