Appunti Biotecnologie microbiche industriali e ambientali - Modulo 1

METAGENOMICA

La volta scorsa abbiamo definito la metagenomica come conseguenza della definizione di

metagenomica, sottolineo questa cosa, ma solo per un aspetto, chiaramente questo si intende

che le cellule che vedremo da qui in avanti sono rigorosamente coltura-indipendenti, cioè non

devono essere basati sulla possibilità di coltivare o meno i microrganismi, è un tipo di approccio

che non deve esserci e non deve nemmeno essere preso in considerazione.

Ad ogni modo per studiare cellule che non possono essere riprodotte in laboratorio, questo vale

anche per le cellule di mammifero, e per studiare il loro genoma, perché è la cosa più informativa

che noi possiamo fare, arriviamo subito alla necessità e alla possibilità di costruire delle

genoteche, o librerie genomiche. Fisicamente come è fatta sta genoteca? La genoteca è

fondamentalmente una coltura di Escherichia Coli, nel 99,9% dei casi, queste colture di coli

contengono oltre a DNA cromosomico, anche dei plasmidi, dei vettori, in cui è stato clonato, in

frammenti più o meno grandi, il DNA completo di un’altra specie, questo è proprio il concetto di

base di una library. È un modo per avere diviso in pezzi il DNA di un organismo, anche diverso,

anche molto più grande, questa coltura di coli si può riprodurre

tutte le volte che voi volete, quindi io posso poi estrarre il DNA da

coli, buttare via il DNA cromosomico, recuperare i plasmidi e i

plasmidi contengono i frammenti, che nel loro insieme sono il

genoma intero di qualche specie. Quindi in linea del tutto teorica

se io potessi prendere il DNA di una ed una sola cellula microbica,

che non posso coltivare, e isolarlo in modo intero, questo è il primo

problema, se potessi farlo a pezzi e clonare tutti i frammenti in un

vettore, secondo problema, a quel punto posso avere quantità anche sulla scala della decina di

grammi di DNA. Questo è solo per dirvi cos’è una library, una genoteca, una libreria.

Idealmente la libreria genomica presenti dei frammenti che presi nel loro insieme rappresentano

il Dna totale dell’organismo che stiamo analizzando.

Uno dei problemi fondamentali dell’inquinamento globale sono gli scarichi in mare, soprattutto

gli scarichi di trasporto di petroli e derivati, una cosa di cui si parla poco, ma forse più importante

è lo stillicidio continuo dovuto al semplice fatto che siccome si spostano migliaia e migliaia di

trasporti giganteschi su mare contenti petrolio e assimilabili, causato da perdite, lavaggi illegali

e scarichi imprevisti.

Siccome l’approccio per la pulizia di questi posti ormai è chiaro che può essere soltanto

biotecnologico, utilizzando soprattutto microrganismi, è chiaro che ci interessa molto, sia a

scopo progettuale sia di analisi e di controllo, sapere

1. quali organismi riescono a sopravvivere ambienti come questi

2. se sono organismi che c’erano prima, anche se ora la comunità è cambiata

3. eventualmente, se c’è un subset di organismi di quella comunità che sta aumentando o

si sta sviluppando, per cui è chiaro che quelli sono gli organismi più importanti da seguire,

perché quelli sono probabilmente da utilizzare in tutto

Quindi fondamentalmente abbiamo la necessità, a dirla molto semplice, di trovare DNA da

campioni ambientali, questo è lo studio metagenomico.

Allora problemi, tanto per cambiare:

1. noi dobbiamo prendere un campione

ambientale, e il primo problema e che è un

problema a cui non è stata trovata una

soluzione definitiva. Teoricamente io dovrei

riuscire ad isolare il DNA di tutte le specie

presenti nel campione, e questo non è possibile

farlo del tutto, ci possono anche essere 20.000

specie in un campione, ma alcune sono

presenti a concentrazioni bassissime, quindi è

chiaro che di quelle sarà estremamente

improbabile riuscire a recuperare frammenti di

DNA rappresentativo, di specie molto frequenti sarà, invece, facile ottenere DNA.

Ad esempio, nel terreno della città universitaria sicuramente troveremo i Bacillus, perché

è una specie che si è adattata ai fitofarmaci che vengono utilizzati.

2. Dunque ci interessa tenere frammenti di DNA di grandi dimensioni. Stabiliamo una cosa,

che questa è una cosa che non vivete perché non appartiene alla vostra generazione dal

punto di vista biotecnologico, il DNA è una molecola delicatissima e anche pipettarlo è

rischioso, perché agiscono delle forze, dette di taglio, che rompono la molecola. Quindi

il DNA in natura è intero, ma noi lo rompiamo in frammenti anche semplicemente

pipettandolo. Perché ci interessano i frammenti grandi? Perché deve essere abbastanza

grande da contenere operoni, perché ci interessano? Parliamo di procarioti, la struttura

genetica (in particolare l’unità trascrizionale) dei procarioti è organizzata in operoni e

quindi certe funzioni, anzi quasi tutte le funzioni, sono in genere dovute ad un cluster di

geni, che sta tutto insieme, ed è sono sotto il controllo del promotore. Se vogliamo andare

ad analizzare i famosi metabolizzatori di petrolio o di carbonio, e volgiamo avere anche

informazioni sugli enzimi coinvolti, sarà bene avere l’operone intero.

3. Purificare da contaminanti chimici che si possono trovare nel campione, in quanto acqua

e terra ne sono ricchi, è importante, perché sono particolarmente ostici per i nostri studi,

in quanto possono inibire gli enzimi del nostro DNA. Quegli stessi contaminanti sono

capaci di legarsi molto bene, sono molecole appiccicose, soprattutto, per ragioni

sconosciute, agli enzimi utilizzati nella tecnica del DNA ricombinante, enzimi di

restrizione, legasi, trasferasi.

Questo è l’esempio più frequente, che prendono il nome di acidi umici, che non sono

nient’altro che gli intermedi metabolici della degradazione di materiale organico,

soprattutto del complesso più difficile da degradare che è la biomassa. Gli acidi umici

sono molto difficili da degradare da parte di batteri.

La purificazione del DNA è sempre un compromesso, tra purezza e dimensioni.

Fondamentale ora è stato tutto molto ingegnerizzato ed è diventato più pratico, esistono anche

dei kit, anche molto mirati.

Lo studio della metageomica è uno studio assolutamente empirico, che va messo a punto di

volta in volta in funzione dello scopo finale.

Allora le library possono essere classificate, grosso modo, in 2 approcci fondamentali:

1. Approcci a piccoli frammenti, in genere <10kb ed è il clonaggio tipico, vecchio stampo,

che è il migliore per sequenziare, ma se volgiamo studiare le funzioni ci serve l’intero

DNA

2. Approcci a grandi frammenti

Queste sono 2 tabelle che raggruppano vantaggi e svantaggi di entrambe le classi di library (vd.

Slide 46- Biodiversità)

Successivamente c’è una scelta, se usare un

sistema fisico o chimico-fisico (più delicato)

per rompere le cellule.

Naturalmente nei laboratori sono stati messi a punto degli accorgimenti per fare delle cose

anche un po’ più raffinate.

Questa per esempio è una metodica che ha avuto, ed ha, molto successo, ed è nata insieme

alla messa a punto dell’analisi microsomiale interna, anni fa è stato messo a punto un sistema

di elettroforesi a campo pulsato (Pulsad-FieldsGelElectrophoresis) che riusciva a far migrare

in gel anche cromosomi interi, anche umani. Banalmente, come si può fare questa cosa? Si può

far in modo di lisare le cellule, in questo caso cellule microbiche,

Si prepara questa sospensione di terra in un tampone adatto ed agarosio, una cosa particolare,

che è fatta a temperature basse, anche tipo 40°C, si mescola bene, poi si versa, con pipette

opportune, molto larghe, in modo da evitare problemi che vi avevo detto, questo pappone, non

so come chiamarlo, viene messo dentro degli stampi e viene lasciato raffreddare, l’agarosio

solidifica e poi si possono estrarre, cosa abbiamo noi qui dentro? Dei cubetti che contengono

dentro la matrice di agarosio, terra e tutto quello

che c’è nella terra, comprese cellule micorbiche. A

questo punto questi cubetti si possono mettere

dentro un contenitore, in cui caliamo la fase liquida,

a questo punto aggiungiamo tampone contenente

agenti litici, tensioattivi e via dicendo. Quindi

facciamo una lisi litica in situ, qual è il vantaggio? Il

vantaggio è, idealmente, che a quel punto le cellule

sono lì ferme in questa matrice di agarosio, però gli

enzimi fanno il loro lavoro, le membrane si

sciolgono e tutto quello che è di peso molecolare

medio-piccolo, la matrice del gel è studiata

appositamente di una certa porosità, per pura dialisi viene perso, si fanno molti cambi del

solvente, alla fine spero che quello che rimane dentro il contenitore è il DNA delle cellule

microbiche ancora speravvolto, come era nelle cellule, però le cellule scompaiono, quindi più

lineare e intero di così non si può.

A questo punto come si usa queste molecole? Si usano, appunto, con l’elettroforesi a campo

pulsato, si usano come punto di partenza e si

inseriscono nella testa del gel, dove c’è il punto

di partenza del gel. Qualcuno non sa che cos’è

il campo pulsato? Elettroforesi significa

applicare il campo elettrico, il campo elettrico

non è pulsato, non è continuo, nel senso che il

campo elettrico non viene applicato come nella

normale elettroforesi, ma viene applicato in

modo ortogonale e questa applicazione pulsa,

cioè cambia nel tempo regolarmente, con

frequenza, c’è un apparecchio che lo fa

naturalmente, in cui si può impostare il voltaggio e il tempo e la durata dei pulsi, quindi c’è un

campo elettrico che non è uniforme, ma fa un zig zag. Qual è l’effetto di questa cosa? Che in

un campo elettrico applicato in questo modo il le molecole di DNA, che sono dei grossi anioni,

migra verso il polo positivo, però con un campo elettrico fatto in questo modo migra come un

serpentello, questa modalità di movimento consente ad una molecola molto grande consente la

migrazione e di separarsi, successivamente posso tagliare il gel in corrispondenza del mio DNA,

che a questo punto è stato anche pulito da eventuali residui. Il gel tagliato la metto dentro una

provetta con un tampone opportuno, come se fosse da dialisi, per far uscire il DNA via via dal

gel. Quindi con questo gel avrò DNA molto ben pulito e di dimensioni elevate.

Un passo avanti, intelligente, nell’allestimento delle metagenoteche potrebbe essere quello di

allestire librerie metagenomiche di cDNA, perch&ea