Appunti Biotecnologie microbiche industriali e ambientali - Modulo 1

Palleschi (lez. 2)

Dunque l'altra volta siamo arrivati a questa diapositiva qui, che è quella famosa storia della nebulosa che vi accennavo prima di chiudere le osservazioni quando il campione era non diluito e che ha dato luogo a questa porzione di microrganismi non coltivabili, con i vari numeri che abbiamo visto l'altra volta.

Approcci coltura dipendenti

Quindi a questo punto partiamo che tutto quello che abbiamo studiato fino ad esso, l'abbiamo studiato ed è tutto quello che c'è sui libri, è fondato su approcci coltura dipendenti, cioè tutto è fatto e studiato su metodiche che dai tempi di Pasteur non sono cambiate per niente. Colture miste, oppure, meglio, colture pure, isolamento di singole colonie, quindi una coltura pura discendente da una singola colonia, assumendo che la colonia si sia originata da una sola cellula, sono le metodiche standard di tutto ciò che voi avete imparato.

Metodiche coltura indipendenti

È chiaro che però a questo punto bisogna mettere a tappeto la possibilità di poter fare gli studi e di ottenere dati con modalità che non dipendono dal fatto che noi possiamo coltivare o meno un certo microrganismo, quindi servono delle metodiche, delle strategie di approccio che siano coltura-indipendenti, questa è una banalità, ma è più facile a dirsi che a farsi. Fino ad oggi tutto è coltura-dipendente, comprese le metodiche standard ufficiali.

Metodo standard coltura dipendente

Questa che voi avete riportato qui, è la metodica standard a norma di legge, cioè pubblicata sulle gazzette ufficiali, per determinare la carica microbica di un campione, quale che esso sia. È una metodica coltura dipendente, che dipende da un principio molto banale, il principio è semplicissimo, dipende dalla coltura in questione, quindi già si assume di avere una coltura o un campione ambientale, riconducibile ad un ambiente. Ad esempio, se è un campione di aria deve essere una certa quantità unitaria di aria filtrata su filtro EPA, cioè un filtro che contiene tutte le cellule viventi microbiche e poi sciacquato, messo dentro un terreno di coltura generico.

Poi ce n'è più di uno a seconda di quello che volgiamo cercare, se, ad esempio, vogliamo cercare delle spore fungine, allora si userà un terreno più adatto alla coltivazione di funghi microscopici, quindi, ad esempio, un pH abbastanza acido, se cerchiamo batteri il pH deve essere neutro.

Principio della diluizione seriale

Comunque si assume che si parta da una coltura o da un campione e che questo campione possa essere diluito in modo seriale fino ad osservare la scomparsa, o l'assenza, di crescita microbica, ad un certo punto della diluizione, quindi il principio è addirittura basato proprio specificatamente sull'osservabilità di crescita microbica. Come si fa? È una cosa molto semplice, si fa un prelievo misurato, unitario, 1mL, ma potrebbe anche essere 1µL, si diluisce con un terreno sterile, in quantità di 9mL, in modo da avere un volume finale di 10mL nella mia provetta. 1mL su 10, la chimica dice che è diluito 10 volte, e quindi questo che cresce qui dentro è concentrata 1/10 di quella che sta là.

Diluizione seriale in laboratorio

Questa diluizione si mescola, si prende un campione di 1mL di questa e si mette in una provetta nuova, contente terreno sterile, quindi 1mL e 9 arriviamo a 10, quindi diluita 10 volte e si mescola, questa provetta diluita 10 volte rispetto a questa, quindi diluita 100 volte rispetto a questa, è la classica diluizione seriale in base 10, la più comune. Lo stesso giochetto si fa per un certo numero di volte, quello che si mette a tempo 0, è semplicemente un'opalescenza iniziale, anche una cosa molto scura, dipende da cosa era il campione, e diventa via via più trasparente o addirittura incolore.

Osservazione statistica della crescita

A questo punto le provette, si arriva anche a 6/7 anche 8 ordini di grandezza, vengono messe in un'incubatrice a temperatura controllata (se sono batteri a 37°C, se sono batteri a 28-30°C), poi dopo 24 ore si controllano, eventualmente si controllano anche con uno strumento apposta capace di misurare la torbidità che in realtà è un indice di rifrazione, comunque quello che si vede è che c'è una torbidità via via decrescente, perché i campioni sono sempre più diluiti, fino a che ad un certo punto il terreno, in cui era stato messo il campione dalla provetta precedente, e quindi teoricamente doveva ottenere qualche cellula, rimane limpido.

Questo vuol dire che nella provetta precedente statisticamente c'è meno di 1 cellula per mL, è una cosa puramente statistica, è un conto probabilistico, infatti il numero che si chiede si chiama Most Probable Number. Questo tipo di esperimento viene fatto, ovviamente, moltiplicato, quintuplicato, dipende dal tipo di esattezza che vogliamo ottenere, sta di fatto che se tutto va bene, se le diluizioni sono state fatte con esattezza, avremo che tutte le provette finiscono di mostrare crescita più o meno nello stesso intervallo.

Quindi si fa un'osservazione statistica quindi noi possiamo dire che questa è l'ultima provetta in cui le cellule crescevano ed erano molto diluite, probabilmente erano tra 1 e 10x10⁵, il che vuol dire che qui dentro c'erano ragionevolmente tra 1 e 10 cellule x 10⁵, perché dopo la sesta diluizione non osserviamo più crescita, questo perché la probabilità di pescare una cellula è bassissima. Quindi è un controllo puramente statistico, basato sull'osservazione di quant'è la diluizione limite che impedisce di osservare la crescita.

Metodica per la determinazione della carica microbica

È chiaro che è una metodica che si basa proprio sul concetto che noi osserviamo la crescita, però, insisto, questa oggi è la metodica per ottenere la carica microbica dell'acqua, del latte, degli alimenti, di quello che volete. Ancora oggi la legge prescrive che per sapere se una certa bevanda è commestibile oppure no, bisogna fare questo tipo di conteggio.

Limiti degli approcci coltura dipendenti

Noi, invece, vogliamo fare un'altra cosa, è chiaro che tutto quello che ho fatto fino ad esso è quello che si poteva fare realmente, avere un approccio coltura dipendente è avere la possibilità di sfruttare al massimo tutte le possibilità scientifiche e tecnologiche a disposizione, perché avendo una certa quantità di cellule, vuol dire che io ho a disposizione DNA, di RNA, tanto per cominciare, ma anche proteine e quindi ho anche cellule per fare esperimenti in vivo, per fare misurazioni, di tipo metabolico, di tipo fisiologico, tutto quello che vi può venire in mente.

Approcci omici e sistemi modello

Questo vale in tutto, vale per l'analisi di metabolomica, di trascrittomica, perché se io ho una certa quantità di RNA di una certa specie, non è facilissimo, pur avendo una coltura, perché gli mRNA sono una piccola porzione del gene, in una cellula microbica saranno meno del 5% degli RNA totali, perché la maggior parte sono soprattutto ribosomiali. I messaggeri sono una piccola porzione degli RNA, gli RNA sono una piccola porzione degli acidi nucleici.

Diciamo che tutto quello che è stato fatto fino ad esso è stato fatto con le cellule in coltura, anche esperimenti sofisticati per quanto riguarda microrganismi, che ormai sono storici voglio dire, per esempio, quello che si chiama tutt'ora il profilo funzionale completo di una specie, sono stati fatti tutti, anche in modo raffinato, perché uno aveva tante cellule a disposizione.

Esempi di profili funzionali completi

Per esempio 2 di questi casi, che credo siano rimasti gli unici 2 completi, è stato fatto un approccio maestonico, in cui ciascun singolo gene di quell'organismo è stato inattivato in modo preciso, mirato e con tecniche particolarmente pensate per effettuare l'esperimento in modo così pulito e raffinato. Che ne so, S. cerevisiae, che uno dei sistemi che usano noi più spesso, il processo di inattivazione genica ancestrale, di tutti i 6600 geni di cerevisiae è stato effettuato progettando una procedura, che prevedeva la sostituzione di ciascuna ORF in modo obliquo, cioè dalla A in TG fino alla seconda A del TA, e sono stati fatti tutti così i gene knockout, in modo da avere una delezione pulita a livello di singolo nucleotide di tutti i geni.

Una cosa simile, non knockout, ma con 24.07 interference, è stata fatta in C. elegans, che è il sistema modello che io conosco, di cui è disponibile una banca dati importante, in cui ci sono i fenotipi corrispondenti all'inattivazione di ogni singolo geni dei 22.000 ca. geni compresi in C. elegans.

Approcci parziali e modelli da ricerca

Negli altri casi sono stati fatti degli studi un po' più parziali, anche meno eleganti. Però questo era semplicemente per dire che, appunto, anche semplicemente avere la possibilità di avere modelli da ricerca, adesso non sto parlando di applicazioni biotecnologiche ma di ricerca di base, anche in settori come fisica o matematica, è necessario avere dei modelli modificabili, che hanno in modo esaustivo un po' tutto; tutte le tecnologie omiche che avete imparato nascono dai sistemi modello, soprattutto da questi ed in particolare il S. cerevisiae.

Ecco su chi è il primo che è stato messo a punto il primo chip DNA? Che inizialmente non era proprio un chip, ma era un foglietto di carta circa 15x15, con sopra gli spot di tutti i geni, poi dopo è diventato un chip sintetico. La trascrittomica, la proteomica ovviamente, la metabolomica anche perché no, diciamo che ha fatto da apri strada a tutte queste tecnologie semplicemente perché l'esaustività delle conoscenze dovute a questo sistema, che è un sistema semplice.

Il resto è venuto dopo, per esempio i microchip per i batteri sono venuti dopo quelli di lievito, curiosamente. Questa cosa è stata usata anche in un momento un po' di speculazione, nel tentativo di definire il set minimo di geni necessari per far funzionare una cellula, poi si è visto che questo approccio era un po' troppo semplicistico nella sua concezione, perché secondo questo approccio inattivando tutti i geni di organismo in parecchi casi le cellule muoiono, in altri no.

Accumulo di dati e approcci molecolari

Attualmente c'è un accumulo notevole di dati, ottenuti tra gli anni degli approcci molecolari e adesso, molecolari, soprattutto di genomica e di sequenze, ad esempio sul sito GOLD, c'è un po' il conto di quello che stanno eseguendo loro, loro stanno seguendo il sequenziamento di una certa quantità di archea, di batteri, di eucarioti, dice a che punto stanno i vari genomi, se ci sono anche trascrittomi, a che punto sta la qualità delle sequenze, e inoltre è molto sintetico e ha molte informazioni sotto forma di grafico, la cosa importante è si sta cominciando ad acquisire dati anche su cellule non coltivabili, anche utilizzando approcci basati su singola cellula, già ve l'avevo accennato, oggi c'è la possibilità di sequenziare il genoma a partire da una sola cellula, non è comodissimo, rispetto ad una coltura con più cellule, ma si può fare.

Difficoltà nella coltivazione in laboratorio

Andiamo al punto fondamentale, perché non riusciamo a farli crescere in laboratorio? Non siamo capaci di far corrispondere l'ambiente di laboratorio a quello che c'è nella realtà, è ovvio è banale, ma questa è la risposta. È che non è chiaro in realtà qual è l'aspetto dell'habitat che noi riusciamo a riprodurre. Lasciando da parte le cose ovvie, banali, che possono essere tutte controllate, come pH, temperature, e via dicendo, quello che viene fuori è la conclusione che sta scritta sotto, e quello che succede è che noi stiamo cercando di unire in laboratorio una condizione che in natura non c'è, nel senso che noi stiamo cercando di ottenere di singoli microrganismi, perché questo è sempre l'approccio standard della microbiologia, colture pure e questo non va bene, perché molti microrganismi in coltura pura non crescono, cioè da soli non vogliono stare, detto in termini semplicistici.

Comunità microbiche

Questa è probabilmente la ragione principale, dobbiamo abituarci a pensare in termini di comunità microbiche e non di colture di singolo microrganismo. Le co-colture, come vengono chiamate in microbiologia, non sono una cosa nuova. Un esempio che, forse, vi convincerà: la produzione vinaria, cioè del vino è un classico esempio di co-coltura o coltura mista, non è una fermentazione alcolica, cioè non è la trasformazione del glucosio dell'uva in etanolo e che viene effettuata da S. cerevisiae, ma è una cosa complessissima, che richiede un sacco di passaggi, dettati dall'esperienza pratica o anche dalle buone pratiche tecnologiche moderne, momenti di chiarificazione, momenti di accentuare situazioni che favoriscano la presenza di certi microrganismi piuttosto che altri.

La produzione vinaria è molto complessa, è un processo in cui entrano in gioco parecchie varietà diverse di microrganismi, batteri e diversi lieviti, in successione più o meno ordinata ed è una cosa molto complessa, anche se in una scala numerica non è così complessa come potrebbe essere quello che succede nel terreno. Questo è un esempio proprio banale di biotecnologie reali, vere.

Comunità di microbi

Quindi quello a cui dobbiamo abituarci un po' è ragionare in termini di comunità di microbi, che interagiscono tra di loro, che funzionano insieme e che in questo modo consentono a moltissimi membri della comunità di vivere in quella comunità, in quella condizione, in quel rapporto numerico con gli altri, presi e messi in un terreno, il più ricco che voi possiate pensare, quelli non crescono, perché gli manca qualcosa che la comunità forniva.

Coltivazione microbica innovativa

In certi approcci un po' naïve attuati, ma non tanto naïve, si cerca semplicemente di usare l'ambiente stesso, questo in soldoni vuol dire semplicemente prendere un metro cubo di terra, e di usarlo proprio come tale, come se fosse un tirreno di coltura microbiologico. Questo è un esempio dimostrativo, che sta sempre nello stesso articolo, di co-coltura, o meglio di co-coltura di tendenza (?), qui c'è una piastra, un terreno di coltura generico per batteri, in cui è stato distribuito in modo uniforme una sospensione diluita di acqua sterile di un campione di acqua dolce. Questa piastra è stata prima incubata per parecchio tempo a temperatura opportuna, e la piastra era assolutamente sterile, cioè sopra non ci cresceva niente. Successivamente è stato aggiunto in un punto preciso uno spot, una microgoccia concentrata di un componente noto di quell'ambiente, quello era coltivabile, dopo 2 giorni osservate una cosa che è un po' il complementare di quello che si vede quando si mette una antibiotico in un terreno di coltura, cioè un alone di inibizione, qui invece c'è un alone di crescita. Potete vedere che vicino allo spot il colore è più vivo e via via diventa sempre più tenue man mano che ci si allontana dallo spot, quindi vuol dire chiaramente che c'è un gradiente di qualcosa che rilasciato su questo terreno di coltura si diluisce nella piastra finché la sua concentrazione non diventa inutile. Questa è proprio la visualizzazione didattica, è stata fatta apposta per far vedere che vuol dire questa cosa.

Progetti di ricerca sulla coltivabilità

In questo momento vi posso anticipare che ci sono molti laboratori nel mondo che come progetto di ricerca hanno quello di aumentare la coltivabilità di microrganismi che esistono in natura, perché qualsiasi cosa che venga portato da non coltivabile a coltivabile ha un grandissimo vantaggio per studi futuri.

Qualcuno ha osservato che alcuni geni, che fanno parte dello stesso gruppo degli actinomiceti o degli actinobatteri, che è lo stesso termine anche actinomiceti è il termine vecchio e actinobatteri è il termine nuovo, sono dei batteri del terreno che hanno la caratteristica di crescere molto lentamente, però sono quelli da cui creiamo la maggior parte delle molecole che noi usiamo adesso, il 90% degli antibiotici deriva da questi. Li facevano crescere, diversamente da quello che uno potrebbe pensare, nei terreni di coltura anche standard, già noti, LB, l'avete sentito nominare? È il terreno dei terreni, è il classico in cui si coltivano tutti i batteri del mondo, usandolo molto liquido anche i batteri che non crescevano ci crescono; se serve il terreno solido, si è visto che in certi casi, invece che questo, che è l'unità ripetitiva di un polimero, notissimo, anche detto agar, che è quell'addensante che si mette per fare le piastre con terreni solidi, conviene usare il gellano, che è un altro polimero, un polisaccaride un po' più complicato, che da un gel molto più trasparente, molto più bello di qualità, è quasi invisibile, un terreno solido non si vede quasi che ci sia, e per ragioni che noi non conosciamo nello stesso terreno gelificato con agar e nello stesso terreno gelificato con gellano c'è una differenza di crescita degli actinobatteri, che è maggiore in quella con gellano, può darsi, ragionevolmente, che l'agar e il gellano sono prodotti industriali, si comprano dalle ditte, quindi la differenza la fanno gli altri componenti del terreno, che spesso non sono neanche citati.

Tecniche di coltivazione innovative

Una tecnica di coltivazione, per esempio, prevede di riuscire a riavvolgere le cellule in un piccolo microambiente, che sia il meno perturbato possibile da altri fattori esterni, anche questo funziona. Questa metodica prevede che un campione alimentato in terra, da cui si possono estrarre cellule, viene incapsulato per semplice mescolamento e gelificazione in microgoccioline di gel (50-100µm), gel polimerici.