Appunti Biotecnologie microbiche

IMMOBILIZZAZIONE CELLULARE

Immobilizzare vuol dire agganciare una molecola o un microrganismo in una struttura che ne

consenta il riutilizzo. Nasce per l’utilizzo con gli enzimi. Invece di purificare un enzima si usa

una cellula integra. Immobilizzare una cellula microbica vuol dire intrappolarla in una struttura

che ne consenta il riutilizzo. Ci sono diversi metodi di immobilizzazione.

Le caratteristiche di un sistema di immobilizzazione.

Sistema che consenti di avere tante cellule in uno

o spazio ridotto.

Deve consentire il passaggio di componenti senza

o avere il passaggio della cellula

Il sistema deve essere poco tossico per cellule e

o operatore

Il primo sistema di immobilizzazione cellulare nasce per la produzione di aceto.

Vantaggi:

Facilità di recupero e di riutilizzo delle cellule

o Le cellule si danneggiano meno e quindi possono essere riutilizzate più volte

o Si lavora ad elevata concentrazione cellulare

o Possibilità di ottenere aggregati di dimensioni ottimali

o

Requisiti:

Il sistema non deve essere tossico per la cellula, per l’operatore e per l’ambiente

o La tecnologia deve essere semplice

o L’immobilizzazione deve essere efficiente anche in termini di tempo

o

TECNICHE: 30

Aggregazione: sfrutta la naturale tendenza delle cellule ad aggregarsi. Questa aggregazione è

favorita in alcune cellule da molecole presenti nella parte esterna della cellula. Ad esempio i

lieviti hanno mannani di parete e spesso vengono legati dalle lectine che si formano in fase

stazionaria e permettono l’aggregazione. In alcuni casi si possono aggiungere ioni carichi

positivamente per facilitare la formazione di aggregati. Lo spessore del film cellulare dipende

dal flusso della fase liquida. C’è un’azione abrasiva tra cellule e liquido. A flusso constante si

ha un equilibrio tra cellule che si sviluppano e cellule esportate, lo spessore del film rimane

costante.

Colonizzazione: è il fenomeno che avviene quando le cellule entrano in contatto con una

superficie ed è favorita dalla struttura esterna della cellula. Una volta agganciata può anche

duplicarsi. È stata sfruttata molto anche nelle cellule animali. Per favorire la colonizzazione si

mette in coltura dischetti di materiale sintetico su cui le cellule possono aderire. Un’altra

tipologia di supporti sono supporti porosi a sferette con grande superficie esterna e interna e

le cellule possono colonizzare l’intera superfice rimanendo anche più protette. La matrice di

questi supporti può essere diversa.

Adsorbimento: adesione della cellula su un supporto tramite carrier. Tendono a non fare strati.

Si sfruttano forze di Van Der Valls.

Game covalente: legame stabile tra supporto e cellula. Permette di avere le cellule saldamente

legate al supporto ma la cellula potrebbe perdere la sua funzionalità.

Intrappolamento: procedure molto studiata e consente di racchiudere

le cellule in un polimero prima che avvenga la reticolazione. Questi

polimeri possono essere di diversa origine sia naturali che di sintesi.

Funziona in funzione del fatto che il polimero si struttura come se fosse

una griglia con delle maglie più o meno sottili. Non si ha legame tra

cellula e polimero. Le perdite di attività sono limitate perché non c’è

coinvolgimento di strutture di membrana. Il problema nasce quando si

hanno aggregati molto grandi. Tra i polimeri più utilizzati c’è

l’acrilamide, Ma ha il problema della tossicità. Rimane una certa tossicità per cellule e

operatore. Il problema di questi gel è che sono molto flessibili, ma si riempiono facilmente. I

usano i polimeri naturali principalmente agar, ma il problema è che è fragile. I polimeri più

utilizzati sono le K carragenine e alginato (polimero che si estrae dalle alghe e consente di

intrappolare le cellule in condizioni blande. Si parte dall’arginato di sodio e lo solubilizza in

acqua diventando una soluzione viscosa ma gestibile, quando diventa alginato di calcio

diventa una struttura porosa con ampia superficie per l’immobilizzazione). La cosa comoda è

che sono sfere e non cubetti, il problema dei cubetti è lo spigolo perché è più fragile.

Contenimento: le cellule sono confinate tramite membrana semipermeabile. I pori della

membrana consentono il passaggio di substrato e del prodotto ma non quello delle cellule

(hollow fiber). A intervalli regolari questi sistemi devono essere fermati e le fibre cave devono

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essere sostituite. A livelli industriale è molto usato. La cellula sta dentro le fibre cave, down

stream molto facilitato.

PRIMA ESERCITAZIONE

Martedì: provetta con MRS e bisogna inoculate Lactobacillus sakei Che va inoculato. Si

o incuberà a 26° per 24 h

Mercoledì: si controlla produzione cellulare e di sakacina. Usa la tecnica della conta

o biologica in piastra con diluizioni decimali. Si verifica la torbidità. Per valutare la

presenza di sakacina si usa Lysteria innocua. Si fanno piastre con Lysteria solida e poi

si inoculano Lactobacillus sakei a diverse concentrazioni e poi si incuba.

Venerdì si valuterà si ci sono gli aloni di inibizione.

o

COLTURE DI CELLULE ANIMALI

Queste colture nascono inizialmente solo per produrre vaccini. Negli ultimi 20 anni è maturato

interesse per attività terapeutiche varie. Le cellule animali sono in grado di modificare cellule

che producono e si utilizzano al posto dei microrganismi perché in grado di fare modificazioni

post-traduzionali. C’è anche attenzione per lo sviluppo di biomassa da utilizzare come tessuti.

Sono interessanti sia per le molecole che possono produrre e sia per la biomassa in se. Ci sono

tipologie di cellule in grado di crescere in sospensione e cellule che per svilupparsi hanno

bisogno di un supporto. Dal punto di vista strutturale parete cellulare differenzia le cellule

microbiche dalle animali, le cellule animali hanno un doppia strato fosfolipidico. Le cellule

animali sono quindi molto delicate. Il tempo di duplicazione è elevato perché le cellule sono

complesse. Ci mettono anche 1 giorno e mezzo per la duplicazione. Quando crescono in un

sistema liquido non crescono tanto, ogni cellula si riproduce massimo una decina di volte. Il

tempo di fermentazione è di 7-10 giorni, a temperatura di 37°C. pH neutro e pressione osmotica

fisiologica.

Glucosio e glutammina sono le fonti preferite di C delle cellule animali. L’ossigeno è necessario

per il metabolismo energetico. Non ci deve essere pressione troppo forte di ingresso dell’aria.

Necessario un ambiente isotonico quindi è necessario avere dei tamponi. Un eccesso di CO2

può inibire la respirazione e portare alla produzione di acido lattico. Le cellule animali

necessitano di componenti come le citochine che sono elementi aggiunti considerati fattori di

crescita.

Le cellule maggiormente usate sono le cellule:

Cellule epatiche di criceto

o Caco2: cellule modello di barriera dell’intestino umano

o HT29-MTX: cellule mucipare del colon umano

o

Roller bottles: bioreattori di cellule animali. Prima dalla tecnologia del DNA ricombinante.

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I Supporti sono i carrier. I microcarrier sono stati messi appunto negli anni '70 ed inizialmente

erano dei dischetti. Con il sistema dei microcarrier si ottiene 20-30 volte coltura in più. Con il

tempo si sono messi a punto carrier microporosi.

Se voglio ottenere cellule che producono metaboliti si possono lasciare i carrier liberi di

muoversi nella coltura oppure si possono confinare tramite spinner basket, il rettore ideale per

la produzione di metaboliti.

L’air lift è un bioreattore molto sviluppato in altezza con agitazione e areazione.

Un altro sistema usato è il sistema a membrane. Cellule stanno in mezzo alle due membrane.

Tutte le molecole prodotte da cellule animali sono importantissime e hanno un valore molto

alto.

Il problema di questi tipi di colture è la contaminazione perché sono cellule non competitive.

COLTURE CELLULE VEGETALI

È Importante in coltura liquida fare crescere cellule vegetali. Si possono ottenere metaboliti

senza dover aspettare di fare crescere la pianta. Le cellule vegetali sono molto grandi, anche

200 micron, ma non sono spesse; sono grandi e sottili. Hanno una parete ma questa

dimensione proporzionata tra superfice e spessore le rende delicate. Tempo di replicazione

superiore alle 24h. Il problema è che i metaboliti prodotti sono spesso trattenuti a livello

intracellulare, questo comporta a necessità di avere un downstream Per estrarre le molecole.

È necessario avere un terreno solido, posiziona un pezzo di vegetale da cui si genera il callo

(agglomerato di cellule). Le cellule vegetali hanno questa caratteristica, la si ritrova anche in

coltura liquida. La coltura liquida di cellule vegetali non è omogeneamente dispersa ma si

ritrovano questi agglomerati.

Nel terreno solido ci sono

Fonte di carbonio: saccarosio 0-30 g/l, doppio due o 3 giorni scompare perché viene

o inglobato dentro le cellule

Macro nutrienti: fonti di azoto, nitrato di ammonio, fosfati di potassio, Ca , zolfo

o Micronutrienti: ioduro di potassio che stimola la produzione cellulare

o Vitamine: soprattutto tiamina

o Ormoni che stimolano la replicazione cellulare

o Altri ingredienti

o

A temperatura è di 20-25°C. Fa eccezione a pianta del tabacco da cui si ricava la nicotina e

questa cresce a 30°C. Non serve la luce perché le cellule non fanno la fotosintesi. A volte la

presenza di luce può impedire l’accumulo di alcuni metaboliti secondari.

Vengono prodotte molte molecole ad attività farmacologica.

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FERMENTAZIONI IN COLTURA SOLIDA Si usano scarti che sono scarti

dell’industria alimentare. Come

fermentazione in stato solido si

usano crusca, sorgo, mais, patate.

Le caratteristiche della

fermentazione in stato solido:

Difficile l’agitazione

o Colture che non contengono

o

tanta acqua

I substrati impiegati sono

o

solitamente naturali

I microrganismi usati sono

o

quelli a forma miceliari perché riescono ad entrare in maniera più aggressiva in questi

terreni granulosi e indi riescono a liberare più glucosio e quindi a crescere.

Vantaggi:

Essendo condotte in condizioni di bassa umidità sono più difficilmente contaminabili

o È possibile condurre la SSF ad alte concentrazioni di substrato.

o Richiedono generalmente costi di servizio minori perché ci sono pochi parametri che

o possono essere controllati

Di solito di down stream se fatto per estrazione richiede una quantità di solvente

o inferiore rispetto a quello richiesto in coltura liquida.

I residui possono essere impiegati nel campo