Appunti esame Biotecnologie microbiche

BIOTECNOLOGIE MICROBICHE

- esame: presentazione (in coppia il tempo duplica, ma si può fare da soli) su uno degli argomenti trattati (15-20min - bisogna

inserire articoli - la presentazione si fa all’appello, prima o dopo le domande) + 16/18 domande a risposta multipla

(32min - non toglie punti) - si può fare a un appello la presentazione a quello successivo le domande, non va fatto tutto

insieme - alla fine del lab si a un test da 15/16 domande a riposta multipla (non fa media, ma aiuta nella media tra le

domande e la presentazione)

INTRODUZIONE

- Vedremo i microrganismi per:

1) Microrganismi nell’ambiente delle plastiche con ruolo di:

1) Degradazione di alcune plastiche

2) Degradazione di sostanze organiche inquinanti

3) Biosintesi di materiali plastici

2) Microrganismi utilzzati per gli studi nella fissazione dell’azoto con effetto rilevante nella fertilizzazione del suolo e del suo

impatto nell’ambiente (azotofissazione)—> l’azoto atmosferico viene trasformato in ammonio

3) Microrganismi che possono svolgere funzioni molto imortanti di protezione delle piante stesse (accumulo di fosforo attorno alle

piante per facilitarne l’assimilazione e produzione di sostanze che permettono alla pianta di difendersi meglio da attacchi patogeni

o microranismi)

4) Microrganismi resistenti agli antibiotici—> alcuni ceppi hanno acquisito multiresistenze a diversi tipi di antibiotici

5) Utlizzo di scarti vegetali per la produzione di biocarburanti o prodotti di interesse industriale—> valuteremo lo studio sui

composti lignocellulosici

- Queste sono le grandi classi di argomenti che tratteremo

MICRORGANISMI NELL’AMBIENTE DELLE PLASTICHE

- L’inquinamento da plastica è relativamente nuovo—> siamo passati da 1,5milioni di tonnellate nel 1950 a 368 milioni di

tonnellate nel 2019 e si pensa che si arrivi a 2.000 milioni nel 2050–> la maggior parte di queste plastiche sono prodotti

dall’elaborazione di derivati del petrolio

SMALTIMENTO:

- A livello mondiale circa il 9% è riciclato, il 12% va in inceneritore (questo incrementa il rilascio di CO2 nell’atmosfera - perdita del

materiale + incremento delle emissioni) e il 79% finisce in discarica/abbandonato nell’ambiente e principalmente si accumula in

fiumi e mari—> questa dispersione ha effetti molto negativi perchè, se da una parte la plastica ha grandi applicazioni industriali,

dall’altra parte, per via della resistenza agli attacchi chimici di degrdazione, comporta una difficile trasformazione (difficile riciclo)

quindi sono facilmente accumulabili nell’ambiente

- A livello europeo abbiamo valori leggermente diversi perchè circa il 6% del materiale plastico è riciclato, il 36% va in

incenerimento e il restante 28% finisce in discarica (% inferirori rispetto a quelle mondiali)

- Gli effetti negativi del materiale plastico, da un punto di vista di inquinamento, possono essere divisi in 3 gruppi:

1) Inquinamento visivo

2) Perdita di biodiversità: la presenza di plastiche nell’ambiente possono avere effetti significativi su sviluppo e vitalità dii

diversi organismi superiori e organismi microbici

3) Cambiamento climatico: le emissioni di CO2 derivate dall’incenerimento hanno effetti sul clima

- A livello macroscopico, un esempio dell’effetto dell’inquinamento da parte della plastica sono l’accumulo di materiale plastico

nell’ambiente oceanico—> a causa delle correnti si sono formate varie zone, la più famosa è nell’oceno pacifico, ma anche

nell’atlantico e nell’indiano abbiamo accumulo di materiale plastico—> si stima che ci siano 8 milioni di tonnellate di materiale

plastico negli oceani

MICROPLASTCHE:

- Le microplastiche (derivanti dalla frammentazione delle plastiche) sono molto pericolose perchè tendono ad entrare nella catena

alimentare con effetti particolamente negativi sul sistema produttivo di diversi organismi con effetti sulla biodiversità con riduzione

delle specie

- Le nanoplastiche sono quelle 1nm a 100nm e le microplastiche da 1um a 1mm

- Effetti delle microplastiche a livello:

1) subcellulare: danni ossidativi e alterazione dell’espressione genica in quanto incidono su fattori di attivazione della

trascrizione

2) cellulare: alterazione della suddivisione cellulare, incremento dell’apoptosi e alterazione del metabolismo degli acidi grassi

3) singlo individuo: alterazione dell’alimentazione, alterazione delle riserve energetiche

4) popolazione: ridotta crescita e alterazione della riproduzione

- Le microplastiche hanno un altro effetto dannoso in quanto, nella produzione di materiale plastico, vengono aggiunti i

plasticizzanti che ne aumentano la resistenza e altre caratterisitche importanti per le industrie—> questi composti, quando si ha

l’invecchiamento del materiale plastico, vengono rilasciate nell’ambiente e alla fine arrivano all’uomo—> 0,7-1,8 milioni di

tonnellate di microplastiche vengano rilasciate nelle acque nellUE

COLONIZZAZIONE MICROBICA DELLA PLASTICA:

- Si è visto che il materiale plastico, integro o frammentato, è un ottimo habitat per la colonizzazione da parte dei microrganismi—>

la superficie del materiale plastico (Plastisfera) può essere ottimale per l’adesione e lo sviluppo dei microrganismi singoli o di una

popolazione mista composta da batteri e funghi—> lo strato di microrgansimi sulla pastisfera vanno a formare un “Biofilm”

- In ambiente marino i primi microroganismi che possono colonizzare questo habitat sono quelli in grado di fissare carbonio e

azoto, microrganismi che non hanno grandi esigenze—> parallelamente a questa adesione ci sono organismi in grado di scindere

il materiale plastico

- Vista la quantità di matriale prodotto, è impensabile che il problema dell’inquinamento da plastica possa essere risolto tramite la

degradazione da parte dei microrgansimi, ma l’applicazione di essi può essere valutata per la complessiva risoluzione del

problema plastico

- Il degradamento deriva dai raggi solari, dagli sbalzi di temperatura e dl frazionamento meccanico (le onde o lo sbattimento contro

materiale solido)—> abbiamo anche enzimi che possono essere funzionali per la degradazione, sono enzimi che agiscono a livello

ossidativo e svolgono un ruolo nell’inizio della decomposizione del materale plastico—> sono enzimi ossidativi perchè i principali

materiali plastici derivano dal petrolio e sono policatene di composti carboniosi con legami C-C (estramente stabili)—> questi

enzimi tendono a indebolire i legami con inserimento di atomi di O al posto di H con degradazione del polimeri e ritroveremo questi

enzimi nei processi di degradazione dei compsti organici inquinanti

AGENTI PLASTIFICANTI:

- Additivi che vengono aggiunti per migliorare le qualità del materiale plastico—> sono composti rilasciati con la frammentazione e

hanno effetti tossici

- Un tipico esempio sono gli Ftlatati (esteri dell’acido ftalico)—> molti di questi ftalati possono essere degradati da diverse tipologie

di batteri perchè il legame estere è facilmente degradabile

PRINCIPALI TIPI DI PLASTICHE :

- Elenco: Nylon, Polietilene teraftalato, Poliuretano, Polietilene, Polipropilene, Polivinil cloride e Polistirene—> “Poli” vuol dire che

sono catene lunghe di composti di base

- Bioplastica: non implica una totale biodegradabilità, ma ha un’origine parzialmente/totalmene derivante da biomassa vegetale

(derivai della cellulosa) o, in alcuni casi, microbica

DEGRDAZIONE MICROBICA DI POLIMERI SINTETICI:

- La tabella riporta la degradazione microbica di polimeri sintetici studiata in laboratorio—> in evidenza abbiamo le condizioni del

laboratorio per lo studio e la durata dell’esperimento (nella tabella “Native community” sono comunità microbiche, non il singolo

batterio)

- Abbiamo una grande divisione tra polimeri idrolizzabili (scissione idrolitica) e polimeri non idrolizzabili (processo degradativo più

complesso)—> la degradazione porta alla produzione di monomeri che, catturati dai microrgansimi, possono entrare nel

metabolismo dei batteri producendo biomassa e, in ambiente aerobico, si ha la liberazione di CO2 + H2O

- Per capire se effettivamente c’è degradazione dobbiamo mettere la plastica in un terreno minerale e valutare se c’è crescita

microbica dopo il contatto dei microrgansimi con la plastica—> i tempi però sono molto lunghi quindi è difficile stimare l’effettiva

crescita rispetto alla degradazione—> un altro parametro da analizzare è se c’è o meno la presenza di CO2–> crescita e CO2

sono i 2 parametri che ci indicano se effettivamente c’è egradazione dell plastica da parte della comunità batterica o del singolo

batterio

- In ambiente anaerobico abbiamo la produzione di Metano al posto della CO2

- Per partire il processo di degradazione gli enzimi devono essere rilasciati esternamente per attaccarsi alla superficie e iniziare la

fratturazione del polimero —> gli intermedi rilasciati sono inglobati nella cellula e, se il microrganismo ha le vie metaboliche

ottimali, si ha la completa mineralizzazione con liberazione i CO2 + H2O (o metano in ambiente anaerobico)

- Elenco per capire se effettivamente c’è degradazione del materiale plastico:

1) Determinazione della perdita di massa: significa che il materiale è stato consumato

2) Identificazione di modifiche della superficie: ci sono analisi al microscopio che valutano le modifiche della superficie della

plastica prima e dopo il trattamento

3) Comparsa di metaboliti

4) Osservazione della crescita microbica a spese del polimero

- Se tutti questi elementi si confermano, significa che abbiamo attività microbica sulla plastica

DEGRADAZIONE MICROBICA DELLA PLASTICA - SFIDE ANALITICHE:

- Test per verificare che di fatto ci sia degradaione:

1) Produzione di CO2 e consumo di O2

2) Marcatura della plastica attraverso C14–> il C marcato permette di monitorare l’evoluzione di CO2 (stretta correlazione tra C

derivande dal substrato e prodotto della CO2)—> la radiomarcatura della plastica è una buona base scientifica per dimostrare

che ci sia effettivamente degradazione

3) Determinazione della perdita di peso: si può monitorare nel tempo la perdita di peso della materia a seguito dell’attività

degradativa

4) Cambio di caratteritische fisiche della plastica che essa può subire attraverso l’attività microbica

5) Analisi termogravimetrica

6) Diminuzione della massa molecolare attraverso cromatografia

7) Variazione della frazione cristallina delle plastiche—> la frazione cristallina si degrada più difficilmente della parte amorfa

quindi è indicie di attività degradativa

8) Alterazioni biocatalitiche delle strutture chimiche—> si usa spettrofotometria infrarossa e la risonanza magnetica nucleare che

permettono di valutare la modifica dei legami C

- Se, nel complesso dello studio, tutti i dati “fittano” tra di loro vuol dire c’è c’è attività degradativa

- I siti dove più facilmente è possibile trovare microrganismi che degradano le plastiche sono le discariche con plastica o le isole

plastiche nel mare—> alcuni microrganismi sono stati isolati da composto

SCARSA BIODGRADABILITA’ DELLE PLASTICHE:

- Uno degli aspetti più complessi per cui è difficile la degradazione

della plastica è la loro scarsa biodisponibilità: polimeri idrofobici poco

accessibili all’attaco dei microrganismi—> la scarsa biodisponibilità è

un ostacolo alla degradazione, ma è un fattore sfavorevole anche per

l’evoluzione di vie degradative

- Albero filogenetico basato sulle sequenze di enzimi correlati alla

degradazione di queste sostanze, ogni colore corrisponde a una

plastica: enzimi identificati e isolati da tutta una serie di microrganismi

diversi che hanno attività degradativa su queste diverse tipologie di

plastiche, la plastica su cui maggiormente si sono ottenuti successi è

il Polietilene Teraftelato (PET)—> l’albero è basato sulle sequenze

AA degli enzimi identificati (per lo più Esterasi e Idrolasi)

- Una grande divisione che si può fare tra le plastiche sintetiche è quella tra le plastiche idrolizzabili (attività idrolitica - scissione

attraverso attività di idrolisi con liberazione di acqua) e polimeri non idrolizzabili—> i polimeri idrolizzabili sono più attaccati da

Cutinasi ed enzimi ossidativi (sono solitamente polimeri in cui l’attività degradativa è più facile) mentre quelli non idrolizzabili sono

solitamente attaccati da processi ossidativi con enzimi Laccasi, Perossidasi e Alcano-monossigenasi (enzimi con specchio

d’azione non molto specifico, sono stati trovati essere attivi anche su polimeri idrolizzabili)

LE PLASTICHE IDROLIZZABILI

POLIAMMIDI SINTETICHE:

- I rappresentanti più prodotti sono i Nylon—> le poliammidi sono composti con formazione di un legame ammidico—> sono state

tra le prime ad essere studiate e hanno microrganismi che le degradano perchè il legame ammidico è un legame per il quale i

microrgansimi hanno già enzimi degradatori

- Gli enzimi che catalizzano le vie di degradazione delle poliammidi sono stati trovati in: Flavobacterium, Pseudomonas,

Arthrobacter e Agromyces (noi scriviamo tutti i generi, ma ricordiamo che solo determinati ceppi di ogni genere sono in grado di

degradare le plastiche)

- Le vie degradative sono: idrolisi e scissione ossidativa del legame poliammidico

- Da Flavobacterium sono stati isolati 3 geni che codificano per una serie di oligomeri idrolasi che attaccano il nylon (i 3 sono:

nylA, nylB e nylC)—> i 3 enzimi sono extracellulari (esoenzimi), una volta ottenuto il monomero (6-amminoesanoato) esso viene

ulteriormente metabolizzato con formazione finale di Adipato (esso viene ulteriormente scisso e i prodotti entrano nel ciclo di krebs

con completa mineralizzazione)

- Sono stati isolati anche microrganismi da ambienti marini, questo perchè un grosso problema dell’inquinamento da plastiche è a

livello marino quindi si cercavano microrgansimi marini in grado di degradare la plastica—> sono stati identificati 4 ceppi (Bacillus

cereus, Bacillus sphericus, Vibrio furnisii e Brevudimonas vescicularis) che sono parzialmente attivi per la degradazione del nylon

—> il B. Cereus si è visto essere quello maggiormente funzionante

POLIETILENE TEREFTALATO (PET):

- Il polietilene è la condensazione di glicole etilenico + acido tereftalico—> il legame che si forma è un legame estere

- Il suo utilizzo maggiore è nelle bottiglie di plastica ed è quello su cui sono stati fatti i maggiori studi con i maggiori successi—>

molti dei ceppi isolati appartengono agi Actinomiceti e quello su cui si sono avuti più caratteristiche è il ceppo Thermobifida Fusca,

un termofilo che permetteva di perdere il 50% del peso della plastica in 3 settimane a 55°C con riduzione della cristallinità del

polimero—> un altro ceppo d Actinomiceti è il Thermomonospora

- Gli enzimi coinvolti nella degradazone del PET ritrovati nei 2 ceppi sono delle Tannasi e alcuni enzimi specifici chiamati “PET

idrolasi”—> altri di questi enzimi fanno parte delle Serina-idrolasi che è composta da una triade catalitica (serina-istidina-acido

aspartico)—> la serina ha attività nucleofila e inizia il processo di idrolisi, gli altri 2 AA della triade servono per stabilizzare la triade

stessa

- Più recentemente è stato isolato un ceppo di Ideonella Sakaiensis da una discarica contenente materiale plastico—> qui, oltre al

consumo del materiale plastico, abbiamo adesione al materiale stesso tramite pili e fimbrie—> su questo ceppo sono stati fatti

numeriosi studi perchè è risultato essere il più performante nella degradazione del PET—> acido protocatecuico è un composto

intermedio chiave nelle vie metaboliche delle vie di degradazione dei composti aromatici, è un interedio a cui le cellule microbiche

sono affini quindi può essere ossidato in vari modi e, aperto l’anello aromatico, il composto viene ulteriormente metabolizzato fino

alla completa mineralizzazione

- Sono stati isolati i geni, purificati gli enzimi ed è stato fatto il cristallo della PETasi di Ideonella—> si è visto che il canale dove

entra il polimero per essere scisso è sempre composto dalla triade vista sopra—> la maggiore attività dell’enzima di Ideonella

rispetto ad altri è dovuto allo spazio del canale catalitico, lo spazzio è molto maggiore in Ideonella rispetto al altri enzimi andando

a favorire l’attività catalitica dell’enzima—> tramite dei mutanti si è visto che, restringendo il canale avevo un aumento dell’attività

catalitica—> con l’analisi cristallografica, analisi molto importante, si può pensare di migliorare l’attività di deradazione andando ad

ottimizzare al massimo gli enzimi (il restringimento si è avuto attraverso enzimi sito-specifici)

- La cristallinità del polimero è un punto chiave della degradazione perchè le regioni a maggiore cristallinità sono le più difficili da

degradare

- In alcuni casi si è visto che se gli step successivi alla scissione del PET sono troppo lenti, l’accumulo degli intermedi può essere

uno dei fattori inibitori

POLIURETANO (PUR):

- Sono condensazione di poliisocianati + poliolo con formazione di gruppi esteri —> i PUR sono molto comuni e fanno parte delle

plastiche idrolizzabili (ex. Sono le schiume nei materassi)

- Si possono formare legami estere tra il carbossile e il gruppo OH dell’alcol o, in alcuni casi, si possono formare legami etere (C-

O-C)—> i PUR con legame etere sono + difficili da degrare rispetto a quelli con legame etere

- Gli enzimi più studiati sono PueB e PueA nel ceppo di Pseudmonas chlororaphis—> utilizza alcuni tipi di PUR con legame estere

come unica fonte di carbonio ed energia—> questi 2 enzimi fanno parte delle Lipasi

- Per identificare i geni deputati alla sintesi degli enzimi coinvolti nella degradazione dei PUR si è preso il microrganismo con

attività degradativa, si estrae il DNA plasmidico e genomico, si frazionano con enzimi di restrizione per ottenere frammenti di un

cerca grandezza e si costruiva una libreria genomica

- In seguito si è fatto uno screening della librera in presenza di PUR—> solo i frammenti con regione codificante per l’enzima volto

alla degradazione formavano un alone intorno alla colonia di E. Coli contenente il frammento (i frammenti venivano clonati, inseriti

in un fago e i fagi venivano inseriti in E. Coli)

- Si è fatto crescere il microrganismo sia in presenza di citrato che in presenza di glucosio e si è osservato che il glucosio

favorisce la crescita del microrganismo, ma inibisce la degradazione—> il citrato non inibisce l’attività degradativa

LE PLASTICHE NON IDROLIZZABILI

- Le plastiche con legami C-C senza gruppi reattivi sono più difficili alla degradazione, sono molto più stabili e quindi ci sono molte

meno tecniche rispetto alle idrolizzabili

- L’azione di destabilizzazione del materiale plastico è derivante prevalentemente da attività di ossidasi (si ha attività ossidativa

rispetto a quella idrolitica delle plastiche idrolizzabili)—> solitamente, per ottenere qualche successo in più, è oppotuno pre-trattare

queste plastichecon attività pre-degradativa (ex. Con reagenti ossidanti o trattamento termico)

POLIETILENE:

- E’ la plastica maggiormente prodotta ed un polimero derivante dalla condensazione dell’Etilene—> non tanto tempo fa sono stati

trovati dei bruchi che mangiano la plastica e, all’interno di questi bruchi, sono stati trovati microrganismi del genere Bacillus ed

Enterobacter, ne tratto intestinale, che hanno attività degradativa sul Polietilene “low density”

- In un ceppo di Pseudomonas è stata vista attività di un’alcano monossigenasi che è stata successivamente clonata in E. Coli—>

una volta clonata è stata monitorata l’attività degradativa sul Polietilene a bassa densità ottenendo risultati parzialmente

soddisfacenti con un 20% di attività degradativa

- Si è visto che anche una Laccasi batterica di Rhodococcus ruber ha dimostrato attività degradativa andando a provocare

l’ossidazione e la riduzione del peso molecolare di film di Politilene pre-irradiati da raggi UV (i raggi UV sono un esempio di pre-

trattamento)

POLIPROPILENE:

- Simile all’Etilene ed è un polimero del Propilene—> a livello di risultati abbiamo qualcosa:

- In alcuni ceppi batterici di Pseudomonas e Bacillus sono state osservate attività degradative

- In corrispettivo abbiamo anche alcuni ceppi funginei con potenziale attività di degradazione

- Alcuni lavori suggeriscono pre-trattamenti e aggiunta di polimeri biodegradabili per stimolare l’attività degradativa sul

Polipropilene

POLISTIRENE (PS):

- Polimero dello Stirene, che possiede un anello aromatico, e fa sempre parte delle plastiche non idrolizzabili—> ci sono alcuni dati

su un ceppo di Rhodococcus ruber che indicano la sua capacità di formare un biofilm con conseguente perdita di peso della

plastica, ma è un processo veramente molto lento

POLIVINIL CLORURO:

- Ha la particolarità di contenere un atomo di Cloro

- Anche qui non abbiamo grandissimi dati, ma quelli che abbiamo sono su un ceppo di fungo

PRE-TRATTAMENTI:

1) La Fotossidazione, in particolare da parte dei raggi UV, è considerata il processo di invecchiamento più importante

2) Esposizione della plastica ad elevate temperature

3) Utilizzo di soluzioni di Fenton, contenenti Ferro, con attività ossidativa quindi tendono a facilitare la destrutturazione del polimero

- Sono tutte strategie che possono portare al miglioramento del processo degradativo

ADDITIVI:

- Gli Additivi, detti anche Plastificanti, che vengono aggiunti a livello industriale, sono composti chimici che molto spesso vengono

rilsciati nell’ambiente se la plastica non viene smaltita correttamente e sono questi che, nella maggior parte dei casi, hanno attività