Appunti Biochimica Marina

Appunti Biochimica Marina

Lezione 1 - 19/02/2018

Vediamo come i principi di biochimica si adattano a diverse esigenze, come in organismi acquatici.

Meccanismi studiati

• Structure and function of proteins of extremophile organisms.
• Structure and function of proteins of organisms living at high pressure
• Adaptation of cell membranes to high pressure and low temperature
• Osmoregulation
• Structure and function of haemoglobins in fish
• Metabolic adaptation of mammalian to marine environment.
• Proteins in the protection from metal pollution

Proteine

Le proteine sono gli strumenti molecolari tramite i quali si esprime l’informazione genetica. Polimeri di amminoacidi, i basilari sono 20. L’amminoacido è composto da un C α con 4 sostituenti diversi:

• 1 gruppo carbossilico [acido] COO-
• 1 gruppo amminico NH3+
• 1 H
• 1 catena laterale o gruppo R. Nel caso in cui ci sia un altro H abbiamo la glicina (non ha stereoisomeri, non è otticamente attivo).

Il gruppo carbossilico è scritto solitamente della forma deprotonata, COO-, e il gruppo amminico è scritto nella forma protonata NH3+. Ci possono essere due stereoisomeri, L o D. Le proteine sono quindi polimeri di amminoacidi e ogni residuo amminoacidico è legato a quello vicino da uno specifico legame covalente. Il termine residuo sottolinea la perdita d’acqua nel momento di unione tra due amminoacidi (legame peptidico).

Tutti i 20 amminoacidi presenti nelle proteine sono α-amminoacidi e differiscono per la catena laterale, o gruppo R, che ha diversa struttura, dimensione o carica e che influenza la solubilità dell’amminoacido in acqua. Il Cα è quindi un centro chirale. I quattro gruppi possono disporsi in due modi diversi nello spazio quindi abbiamo due stereoisomeri che appartengono alla classe degli enantiomeri (speculari e non sovrapponibili). Tutte le molecole con un centro chirale sono otticamente attive ossia ruotano il piano della luce polarizzata.

La configurazione assoluta dei quattro sostituenti sul Cα viene descritta dal sistema D, L, basato sulla configurazione dello zucchero a 3 atomi di carbonio Gliceraldeide, proposta da Fisher nel 1891. I residui amminoacidici nelle molecole proteiche sono SOLO stereoisomeri L. Gli amminoacidi della serie D sono presenti solo in pochi peptidi, come quelli della parete cellulare dei batteri. I gruppi funzionali degli L-amminoacidi vengono appaiati a quelli della L-gliceraldeide, allineando quelli che possono essere interconvertiti tramite semplice reazione chimica.

Prolina: gruppo laterale non rilevante; si ripiega a fare un legame covalente con il gruppo amminico imminico.

Valina, Leucina, Isoleucina: ramificati, possono entrare direttamente nel muscolo.

Tirosina: si può avere fosforilazione perché ho il gruppo OH.

Un altro sistema per indicare la configurazione intorno ad un centro chirale è il sistema RS, usato nella nomenclatura sistematica della chimica organica. In questo sistema, ad ogni gruppo legato ad un carbonio chirale è assegnata una priorità:

• -OCH3 > -OH > -NH2 > -COOH >
• -CHO > -CH2OH > -CH3 > -HN.

Nella nomenclatura RS, il gruppo con la priorità più bassa (gruppo 4) viene posto nella posizione più lontana dall’osservatore. Se la priorità di altri gruppi diminuisce andando in senso orario, la configurazione è R; se la diminuzione è in senso antiorario, la configurazione è S. Gli amminoacidi possono essere raggruppati in 5 classi principali sulla base delle proprietà del loro gruppo R. Si utilizza la polarità, ossia la tendenza ad interagire con l’acqua a pH fisiologico (7,0).

Classificazione degli amminoacidi

Gruppi R alifatici non polari

I gruppi R sono NON polari quindi sono idrofobici. Le catene laterali di alanina, valina, leucina e isoleucina si raggruppano all’interno delle proteine stabilizzando la struttura terziaria tramite interazioni idrofobiche. La glicina ha la struttura più semplice, ma la sua minuscola catena laterale non contribuisce alle interazioni. La metionina, uno dei due aa contenenti zolfo, ha un gruppo tioetere non polare sulla sua catena laterale. La prolina ha una catena laterale alifatica con struttura ciclica. Il gruppo amminico secondario (imminico) è mantenuto in una conformazione rigida che riduce la flessibilità strutturale.

Gruppi R aromatici

Fenilalanina, Tirosina (ci può essere fosforilazione) e Triptofano sono relativamente non polari (idrofobici). Il gruppo ossidrilico (OH) della tirosina può formare legami idrogeno. La tirosina e il triptofano sono sensibilmente più polari della fenilalanina a causa del gruppo ossidrilico della tirosina e dell’atomo di azoto nell’anello del triptofano.

Gruppi R polari, non carichi

I gruppi R di questi sono più solubili in acqua dei gruppi R non polari, perché contengono gruppi funzionali che formano legami H con l’acqua. La polarità della serina e della treonina è dovuta al loro gruppo ossidrilico, mentre quella dell’asparagina e della glutammina al loro gruppo amminico (NH2). La cisteina è un caso particolare perché la sua polarità è modesta e dipende dal gruppo solfidrilico; è un acido debole che può formare legami H deboli con O e N. In ambiente ossidante la forma può essere ossidata. La cisteina è facilmente ossidabile e forma un dimero chiamato cistina con un ponte disolfuro. I residui di cisteina uniti dal ponte sono molto idrofobici (non polari). Asparagina e glutammina possono essere convertite mediante idrolisi basica o acida in aspartato e glutammato.

Gruppi R carichi

I gruppi R più idrofilici sono quelli che contengono cariche nette sia positive che negative.

a. Positivamente (basici)

Gli aa con una catena laterale con carica netta positiva a ph 7,0 sono lisina, arginina e istidina. L’istidina è l’unico amminoacido delle proteine ad avere una catena laterale ionizzabile con un pKa vicino alla neutralità; a pH 7 l’istidina ha l’anello imidazolico parzialmente protonato, ecco perché viene classificata come carico positivo.

b. Negativamente (acidi)

I due aa con R carico negativamente sono aspartato e glutammato, ognuno dei quali ha un secondo gruppo carbossilico (COO-). Un gruppo è acido quando facilmente cede i propri elettroni. Ecco perché diciamo che il gruppo carbossilico è un acido, facilmente deprotona perché ha un pK molto basso. A qualsiasi pH superiore a 2 è tutto deprotonato. Per avere tutto protonato devo andare a ph inferiore a 2. L’Istidina è l’unica che ha un pk che si avvicina al ph fisiologico. Importante per il funzionamento dell’emoglobina. Tutti gli organismi sono tamponati (pH fisiologico 7.2/7.3).

Titolazione degli amminoacidi

I gruppi COO- e NH3+ possono essere protonati o deprotonati. Se un gruppo è acido, si libera facilmente del protone (H+) che va in soluzione e ne aumenta la concentrazione. L’aumento di concentrazione di ioni H+ in soluzione causano un aumento di acidità e una diminuzione di pH.

Gruppo carbossilico = pH molto basso

Gruppo amminico = se pKa=9 vuol dire che se voglio il gruppo amminico deprotonato devo andare a pH >9; in tutte le altre situazioni è protonato.

Gruppi laterali (citosina/tirosina) = tendenza a variare stati di protonazione con pH alti.

Questo grafico rappresenta lo stato di protonazione dell'acido acetico al variare del pH. A un pH inferiore al pKa, l'acido è protonato. A un pH superiore al pKa l'acido è deprotonato. Se il pH è uguale al pKa, l'acido è al 50% protonato e al 50% deprotonato. La forma completamente protonata ha carica netta +1. La forma completamente deprotonata ha carica netta -1. La forma neutra (positiva su un gruppo e negativa sull’altro) ha carica netta 0 e viene chiamata zwitterione. Il pH caratteristico al quale la carica netta è zero è detto Punto isoeletrico (pI). Per avere tutti i gruppi protonati ho bisogno di tanti H+ nella soluzione quindi mi trovo a pH acido (molto basso). Per avere la forma deprotonata devo essere in una soluzione che contiene pochi protoni.

I gruppi amminici e i gruppi carbossilici degli amminoacidi si comportano come acidi e basi deboli. Quando un aminoacido che non possiede R ionizzabile viene sciolto in acqua a pH neutro, si trova sotto forma di ione dipolare o zwitterione e può comportarsi da acido (donare i protoni) o da base (accettare protoni). Questi composti sono detti anfoterici o anfoliti.

Possiamo titolare un amminoacido per vedere il suo pKa: La glicina ha un idrogeno come catena laterale quindi come gruppi deprotonabili ha solo il gruppo amminico e il gruppo carbossilico. Se da zero aumento la concentrazione degli equivalenti di OH-, all’inizio ho tutto completamente protonato, finché non arrivo ad un certo punto a cui si deprotona il gruppo carbossilico (che ha un pk 2,34). Il gruppo amminico invece si deprotona a ph molto alto (pk 9.60). Osservando il grafico mi rendo conto che ha due regioni con potere tamponante.

I due gruppo COOH del glutammato sono acidi uguali? Il primo dei due che si deprotona è il gruppo COOH legato al C alfa. Questo è quindi quello più acido; si libera più facilmente del protone perché ha una carica positiva (gruppo amminico) vicino che lo repelle. A ph fisiologico sono deprotonati tutti e due. Il grado di protonazione di un gruppo dipende quindi dai gruppi vicini. È rilevante perché nei ripiegamenti delle proteine capita che si trovino gruppi positivi vicino a quelli che devono deprotonarsi.

Legame peptidico

Si forma per condensazione (espulsione di una molecola d’acqua). Il legame C – N diventa un parziale doppio legame. Infatti, l’ossigeno su C e l’idrogeno su N sono sempre riportati in trans. Il legame peptidico si forma sui ribosomi ad opera dell’RNA e non ha proteine che catalizzano la sua formazione. La scissione del legame peptidico può avvenire tramite l’enzima proteasi. L’equilibrio della reazione tende verso gli amminoacidi rispetto al dipeptide. Per rendere questa reazione termodinamicamente favorevole, il gruppo carbossilico deve essere modificato o attivato.

Alla fine degli anni '30, Pauling e Corey analizzarono il legame peptidico e gettarono le basi per la comprensione della struttura delle proteine. Gli atomi di Cα di residui amminoacidici adiacenti sono separati da 3 legami covalenti: Cα – C – N – Cα. Attraverso studi della diffrazione dei raggi X su cristalli, il legame C – N è stato dimostrato essere più corto del legame C – N delle ammine e gli atomi di questo legame sono complanari. Queste osservazioni indicano quindi la presenza di una risonanza o di una parziale condivisione di due coppie di elettroni tra l’ossigeno carbonilico e l’azoto amminico.

L’ossigeno ha una parziale carica negativa, mentre l’azoto una carica parziale positiva, generando così un piccolo dipolo elettrico. I sei atomi del gruppo peptidico giacciono sullo stesso piano e l’atomo di ossigeno del gruppo carbonilico (C=O) è in posizione trans rispetto all’atomo di idrogeno legato all’azoto.

I legami C – N, a causa del parziale carattere di doppi legami, non possono ruotare liberamente; mentre è permessa la rotazione dei legami C – Cα e N – Cα. Sono quindi una serie di piani consecutivi che hanno in comune un carbonio (Cα). La rigidità del legame peptidico limita il numero delle conformazioni possibili. La conformazione del peptide è definita da tre angoli diedri (angoli di torsione) chiamati:

• φ (phi)
• ψ (psi)
• ω (omega)

che riflettono la rotazione intorno a ciascuno dei tre legami. I legami N – Cα e C – Cα possono ruotare descrivendo angoli diedri (rispettivamente φ e ψ), il legame omega non può ruotare. Ψ e φ possono assumere qualsiasi valore tra -180° e +180° ma alcuni valori non sono permessi a causa dell’ingombro sterico. I valori permessi sono riportati nel grafico di Ramachandran. Le conformazioni considerate possibili sono quelle che non presentano interferenze steriche, basate su calcoli in cui sono utilizzati i raggi di van der Waals e gli angoli di legame.

Le aree in blu contengono le conformazioni che non presentano contatti o sovrapposizioni, quindi sono completamente consentite; quelle in blu intermedio indicano le conformazioni permesse, se gli atomi possono avvicinarsi gli uni agli altri di 0,1 nm. Le aree in azzurro rappresentano le conformazioni permessese è consentita una certa flessibilità all’angolo diedrico ω che descrive il legame peptidico stesso, generalmente mantenuto a 180°. L’asimmetria che si osserva nel grafico dipende dalla stereochimica L dei residui amminoacidici. I grafici di altri L-amminoacidi con catene laterali non ramificate sono identici a questo. Le regioni permesse per amminoacidi ramificati come Val, Ile e Thr sono più ristrette di quelle del residuo Ala. Gly non ha impedimenti sterici e presenta la zona permessa più ampia. Pro ha impedimenti considerevoli in quanto i valori dell’angolo φ sono limitati dalla catena laterale ciclica tra – 35° e -85°.

Struttura e funzione delle proteine

Le proteine si distinguono per percentuali amminoacidiche relative e per la grandezza (quanti residui amminoacidici).

Proteina = unità funzionale (catena polipeptidica)

L’emoglobina è una proteina (ossia un’unità funzionale) singola, composta da due subunità cioè da 4 catene polipeptidiche. Ogni subunità è codificata da un gene. Ha anche dei gruppi prostetici (come il gruppo eme).

Gruppo prostetico:

• Lipidi -> lipidoproteine (come la classe di proteine che impediscono il congelamento dei pesci)
• Carboidrati -> glicoproteine
• Ferro, zinco, rame -> metalloproteine

Quattro strutture delle proteine

• Primaria: amminoacidi -> sequenza
• Secondaria: ripiegamento locale della catena stabilizzato da legami idrogeno tra H (legato all’azoto) e O (del carbonio carbonilico)
• Terziaria: ripiegamento totale della proteina, stabilizzata anche da interazioni delle catene laterali
• Quaternaria: più subunità che si ripiegano insieme

Legame idrogeno: l’interazione tra un atomo di H covalentemente legato ad un atomo elettronegativo e compartecipato da un altro atomo anch’esso elettronegativo. È il legame più importante per tutte le strutture (DNA, RNA, proteine).

Alfa elica è una catena polipeptidica che si ripiega ripetutamente intorno ad un asse, destrorso. In ogni giro ci sono 3,6 amminoacidi; si formano legami idrogeno tra gli amminoacidi che ad ogni giro si trovano sulla stessa verticale (primo e quarto) e i gruppi laterali guardano verso l’esterno. Tutta le cariche sono mascherate, non c’è carica, per questo può facilmente passare attraverso la membrana lipidica. L’azoto con l’idrogeno porta una piccola carica positiva, l’ossigeno invece porta una piccola carica negativa. Queste cariche sono invece mascherate dal legame idrogeno.

Ripiegamento beta la prolina è molto utilizzata in questa struttura e la glicina per il suo poco ingombro.

Foglietto beta legame idrogeno tra H e O con un’altra catena o con la stessa catena ripiegata. Quando curva per tornare indietro si crea il β-giro.

Strutture supersecondarie

• Ansa βαβ (alternanza di 3 strutture secondarie, un foglietto beta, un alfa elica e un altro foglietto beta)
• Barile β possono attraversare membrane, ma rappresentano solo l’1% di tutte le molecole che le attraversano. Tutti i potenziali legami H sono soddisfatti (acquaporina). Il 99% delle proteine che attraversano la membrana sono alfaeliche. L’1% sono barile beta.

Quando ho legato 10-12 aa, la proteina comincia a ripiegarsi, appena esce dal ribosoma. È sufficiente a prevedere la struttura che avrà. Se prendo una proteina, la denaturo (con solventi organici o con cambiamenti di T o pH) e poi torno alla situazione di partenza, la proteina torna alla forma iniziale. Molte proteine assumono automaticamente la struttura. Come faccio ad associare gli aa giusti? Il folding è guidato dall’acqua (che ha dislocazione di carica). È un fluido, i legami idrogeno che stabilizzano le molecole d’acqua sono legami deboli, cambiano continuamente. L’effetto idrofobico è considerato responsabile del ripiegamento delle proteine in cui i residui con catene idrofobiche laterali si ripiegano verso l’interno. L’acqua tende a formare gabbie ordinate intorno ai gruppi non polari (idratazione idrofobica) che porta ad una diminuzione di entropia. Il processo di idratazione risulta pertanto energeticamente sfavorito, quindi le molecole apolari tendono a raggrupparsi riducendo al massimo la superficie esposta al solvente. Folding corretto: l’unica struttura con l’energia più bassa. Quindi la struttura è stabile. Proteine chaperon: aiutano l’acqua a spingere i residui idrofobici vicini. Lavorare con le proteine significa anche comprendere questi concetti fondamentali per affrontare le sfide biochimiche legate all’adattamento in ambienti estremi, come quelli marini.