Appunti anatomia patologica

Appunti di anatomia patologica

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Fondatore anatomia patologica: Morgagni ad ogni alterazione anatomica corrisponde un’alterazione funzionale.

Svolge un ruolo fondamentale per la pianificazione di eventuali terapie mediche fornendo diagnosi su tessuti o

cellule prelevate da pazienti in cui si sospetta una malattia. L'indagine anatomopatologica permette di distinguere

tra tessuti normali, infiammazione, tumori benigni e maligni ed altre condizioni patologiche. 

Nel laboratorio di anatomia patologica vengono effettuati: esami citologici (citologia esfoliativa cellule esfoliate

spontaneamente: urine, espettorato, secrezioni); citologia per esfoliazione provocata, citologia per aspirazione con

ago sottile), istologici (biopsie su tessuti/organi, esame estemporaneo con criostato, prelievi autoptici), patologia

molecolare (evidenziazione dna, analisi molecolari di tumori per riconoscimento e caratterizzazione).

Il tecnico è responsabile dell’intero processo di sua competenza. Deve: verificare l’idoneità del materiale, redigere

eventuali non conformità, processare i campioni, attuare validazione tecnica, eseguire la manutenzione; per quanto

riguarda le abilità tecnico-diagnostiche deve saper: allestire preparati isto-patologici, eseguire colorazioni, eseguire

tecniche immunochimiche e immunoistochimiche, eseguire esami in regime d’urgenza, collaborare con la gestione

degli archivi. Deve inoltre: osservare al microscopio i preparati di screening, eseguire tecniche di microscopia

elettronica e applicare le tecniche autoptiche.

Preanalitica: preparazione, conservazione, identificazione, trasporto, accettazione e registrazione del campione.

Analitica: esame macroscopico e prelievi, processazione, inclusione, taglio, colorazione, tecniche speciali, esame

microscopico e referto.

Post-analitica: consegna del referto, comunicazione delle diagnosi critiche, archiviazione.

TLB è responsabile di validazione tecnica in tutti e 3 questi processi.

Principali errori: e. accettazione, e. campionamento, e. processazione, e. taglio, e. colorazione, e. consegna

preparati.

TECNICHE ISTOLOGICHE

Tecniche di preparazione che permettono l’osservazione al microscopio di un preparato. Il preparato deve essere

sottile in modo che possa essere attraversato dalla luce del microscopio. Il campione è trasparente, deve quindi

essere trattato con sostanze coloranti che contrastino le strutture cellulari.

Fasi: 

1) Prelievo composto da espianto, sezionamento e lavaggio. Il materiale prelevato deve essere fresco; la

fase successiva deve avvenire nel minor tempo possibile, per evitare alterazioni, se non è possibile i trattati

devono essere refrigerati. I pezzi da fissare non devono superare 1cm di diametro. La fase di sezionamento

preliminare deve avvenire sempre in ambiente umido, per evitare l’essiccamento del campione che

potrebbe produrre alterazioni nel tessuto. Quindi, il sezionamento deve avvenire a campione immerso in

soluzione fisiologica, o anche al di sopra di garze imbevute di soluzione. Una volta sezionati i campioni

vengono lavati in soluz. fisiologica.

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2) Fissazione operazione più importante della preparazione istologica, da essa dipende la buona riuscita del

preparato. Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla stabilizzazione di componenti

tessutali con minima dislocazione ed estrazione dei composti nativi. La FORMA delle cellule e dei tessuti

deve venir conservata il più possibile simile alla condizione vitale. Scopo: immobilizzare i costituenti del

campione, consentire al preparato di sopportare gli stress fisici e chimici delle fasi successive, proteggere il

campione dall’attacco di muffe, batteri e da processi putrefattivi, mantenere inalterate le reattività

enzimatiche delle cellule. Un buon fissativo deve avere: elevato potere di penetrazione, fissazione

uniforme, no coartazione tessutale, compatibilità con colorazione immunoistochimiche. La scelta del

fissativo dipende da: tipo di tessuto da analizzare, quesito diagnostico, colorazione da utilizzare, tipo di

strumenti utilizzati per l’analisi microscopica. Essendo la massima parte dell'architettura cellulare costituita

da proteine, la scelta di un fissativo idoneo dovrà ricadere su un componente riconosciuto come ottimo

stabilizzatore di queste macromolecole. Tecniche di fissazione: per immersione (sommergere il tessuto in

liquido fissativo con rapporto 1:10), per perfusione (limitata agli animali da esperimento, il fissativo viene

iniettato nel vaso sanguigno per raggiungere l’organo bersaglio), per uso di vapori (vapori che si liberano da

soluzione fissativa riscaldata, utilizzata per applicazioni particolari es. amine biogene in

immunoistochimica). Classificazione funzionale:

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f. coagulanti modificano in modo irreversibile la struttura terziaria delle proteine. Etanolo

(fissativo blando, indurisce materiale, annulla reattività enzimatica), metanolo (per fissazione di

strisci di sangue), acetone (intensa coartazione tessuto, usato in miscele), acido picrico (composto

esplosivo, conferisce colore giallo al campione, coarta i tessuti per questo è utilizzato insieme ad

acido acetico che previene questo effetto), cloruro di mercurio ( detto sublimato corrosivo, molto

tossico, usato in miscele, usato per pezzo di piccole dimensioni perché è poco penetrante),

triossido di cromo (è il fissativo più ossidante, impedisce azione di coloranti basici, scarsamente

penetrante, considerato ottimo per nucleo e cromosomi).

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F. non coagulanti cross linking: formazione di legami crociati tra polipeptidi all’interno di una

stessa proteina o di proteine vicine. Stabilizzano conformazione nativa della proteina. Formaldeide

(il più usato, ha un elevato grado di penetrazione e non provoca eccessivo indurimento dei tessuti,

non dissolve i lipidi, possibile immersione per lungo tempo; è un gas ma viene utilizzata in forma

acquosa: formalina, utilizzata in concentrazioni tra 4-10%; in soluzione acquosa si trova nella sua

forma attiva di glicole metilenico; forma legami covalenti metilenici e realizza il «cross-linking» intra

ed intermolecolare tra i gruppi adiacenti, bloccando, modificando e distruggendo gli epitopi;

stabilizza le strutture secondarie; formaldeide 4% (formalina 10%) velocità di penetrazione: 0,5 cm

in 24h), tretrossido di osmio (rende tessuto friabile, buono per evidenziare le membrane, fissativo

per eccellenza della microscopia elettronica), bicromato di potassio (usato in miscele, usato per

fissare i mitocondri, necessità di lavaggi prolungati per evitare precipitazione di ossido di cromo),

acido acetico (usato sempre in miscele, solidifica a 17°, ha un eccellente potere di penetrazione,

fissa molto bene i nuclei, ma non coagula le proteine, né fissa o solubilizza i lipidi).

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Miscele fissatrici a base di alcol liquido di serra (alcol etilico + formaldeide + acido acetico),

liquido di carnoy (alcol etilico + cloroformio + acido acetico), liquido di clarke (alcol etilico + acido

acetico), formalina alcolica di lillie (alcol etilico + formaldeide), liquido di bouin (acido picrico +

formaldeide + acido acetico), liquido di duboscq – brasil (alcol etilico + formaldeide + acido acetico

+ acido picrico).

Pericolosità fissativi: formaldeide (infiammabile, irritante, cancerogeno per inalazione e contatto), alcol

(rischio incendi), acido picrico (nocivo), tetrossido di osmio (irritante e tossico). Fissazione fisica:

mediante calore, freddo e le microonde.

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3) Lavaggio lavaggio in acqua corrente post-fissazione allo scopo di eliminare l’eccesso di fissativo che

potrebbe reagire con i reattivi impiegati nelle fasi successive, in particolare con i coloranti.

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4) Disidratazione le sostanze includenti essendo idrofobiche non riuscirebbero a infiltrare i campioni che

contengono acqua nei tessuti e nelle cellule; è necessario procedere alla disidratazione per sostituire

l’acqua con un mezzo che sia miscibile con le sostanze di inclusione. Può essere effettuata con un qualsiasi

agente chimico anidro. Il più utilizzato è l’etanolo, con l’applicazione di soluzioni a concentrazione

crescente di questo disidratante in acqua (50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%). Non è consigliabile far

permanere il preparato per tempi lunghi nella stessa soluzione, l’eccessiva esposizione ad etanolo potrebbe

provocare un indurimento del campione. Errori: saltare uno step, disidratazione troppo veloce).

Solitamente si utilizza un processatore automatico.

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5) Chiarificazione (o diafanizzazione) l’etanolo non è miscibile con la paraffina quindi bisogna sostituirlo con

un solvente intermedio che sia miscibile con entrambi. Questa procedura si chiama chiarificazione in

quanto rende molto trasparenti i campioni. Gli agenti di chiarificazione più utilizzati sono lo xilolo e il

toluene (sostituiscono rapidamente l’etanolo ma induriscono), ed in minor misura il benzolo e il

cloroformio (sostituiscono lentamente l’etanolo ma induriscono poco). Nella pratica si immerge il campione

in etanolo-xilolo (50%-50%) e poi in xilolo puro.

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6) Inclusione procedura che consente di preparare il tessuto in modo tale da ottenerne sezioni di spessore

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adatto al tipo di osservazione. Per ottenere le sezioni il tessuto deve avere una consistenza adatta scopo

dell’inclusione. La sostanza più usata per la preparazione di blocchetti di materiale incluso è la paraffina

(miscela di idrocarburi saturi ad elevato PM, solida a temperatura ambiente, liquida a 56°). Passaggi di

infiltrazione: xilolo-paraffina (50%-50%), paraffina pura. Ad infiltrazione completata, i campioni vengono

immersi in contenitori sagomati in cui viene fatta colare paraffina liquida, ed il tutto viene lasciato

solidificare a temperatura ambiente. Quindi, il blocchetto solido viene estratto dal contenitore e processato

per la successiva fase. I tempi minimi di infiltrazione sono di tre ore. L’inclusione dei campioni va sempre

effettuata sul taglio effettuato dal patologo. L’inclusione di tessuti frammentati va fatta cercando di

concentrare i frammenti in un “base model” di adeguate dimensioni. Difetti di inclusione: campioni

morbidi, gommosi, troppo duri o friabili (errori nelle fasi precedenti e nell’inclusione). Come rimediare agli

errori: effettuare nuova processazione con 1) metodo della “processazione inversa”: sciogliere paraffina,

xilele per togliere paraffina, alcol per reidratare, acqua corrente, riprendere processazione dagli alcol; 2)

metodo taggart: porre cassetta con campione incluso in soluzione salina e poi in termostato per 1h e poi

riprendere la processazione da alcol; 3) effettuare nuova processazione con ciclo di pulizia modificato del

processatore e poi riprendere la processazione da alcol.

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7) Sezionamento effettuato utilizzando microtomo (a rotazione è quello più diffuso). Microtomo costituito

da 3 elementi: gruppo porta preparato, dispositivo porta-lama, un corpo che li supporta. Principio di

funzionamento: braccio oscillante su cui si monta il blocchetto di paraffina; esso ad ogni oscillazione scivola

contro la lama; il movimento è azionato da una manovella ed è il movimento di questa che causa il

progressivo avvicinamento del blocchetto alla lama di una distanza pari allo spessore di sezione desiderato

(lo spessore può essere impostato da 1 a 50 µm). Si formano nastri di sezioni e man mano che crescono

durante il taglio, il nastro dovrà essere retto utilizzando un pennellino. Ottenuto un numero di sezioni

soddisfacente, sarà necessario prelevare l'intero nastro e appoggiarlo in una vaschetta contenente acqua

distillata riscaldata (40-45°C), che distenderà il nastro. Quindi si raccolgono le sezioni sul vetrino

portaoggetto immergendo quest’ultimo nell’acqua al di sotto delle sezioni, e facendolo riemergere in

posizione obliqua. Il vetrino sarà posto ad asciugare su una piastra riscaldata e poi in un termostato a 30-40

°C. Criostato: il raffreddamento di questo strumento è ottenuto tramite uno o più compressori. Il

microtomo è racchiuso all'interno della camera criostatica ed è azionato manualmente dall'esterno tramite

una manopola. Il campione da analizzare può essere congelato esternamente (ad es. in azoto liquido),

oppure congelato direttamente all'interno del criostato su un'apposita "barra di congelamento". Il

campione congelato verrà posizionato in un inserto portacampione e sezionato.

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8) Reidratazione la sparaffinatura è un procedimento che assicura che venga eliminata in modo che il

tessuto possa essere impregnato dal colorante. E’ necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed

idratare gradualmente il tessuto sino all’ H2O distillata (xilolo, etanolo 100°, etanolo 95°, etanolo 70°,

etanolo 50°, acqua distillata).

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9) Colorazione il fine è quello di aumentare il contrasto dei componenti morfologici cellulari o tessutali

(colorazione istologica) affinché ne risulti una migliore analisi microscopica, oppure quello di identificare

specifiche sostanze chimiche all’interno di una cellula (citochimica) o di un tessuto (istochimica), in

quest’ultimo caso si sfrutta la proprietà di alcuni reagenti di formare con specifici composti chimici

contenuti in cellule e tessuti dei prodotti colorati. Colorante: molecola solubile fornita di colore proprio

capace di legarsi a substrati; substrato: composto chimico costituito da una componente (cellulare o

tessutale) identificabile morfologicamente. I coloranti possono essere classificati in: coloranti naturali

animali, naturali vegetali, artificiali (in cui si trovano gruppi chimici detti cromofori dai quali dipende il

colore). Colorazione vitale: colorante somministrato su un animale vivo; colorazione sopravitale: colorante

usato per trattare tessuti o cellule isolate ma vive. I coloranti contengono 2 gruppi principali: il cromoforo

(capace di conferire colore alla sostanza, pur non avendo proprietà coloranti di per sé; è capace di assorbire

le radiazioni, il colore che riflette è correlato a quello di assorbimento) e l’auxocromo (introdotto in una

sostanza la trasforma in sostanza capace di colorare; è un gruppo ionizzabile responsabile della solubilità

del colorante, della sua ionizzabilità e della sua capacità di creare legami con tessuti; a seconda della carica

assunta in soluzione si distingue in: acido quando ionizza come anione, basico quando ionizza come catione,

caratteristica che distingue i colorante in acidi e basici) uniti covalentemente tra loro. I coloranti possono

essere classificati in: acidi (auxocromo costituito da gruppo solfonico, carbossilico, idrossilico, formano Sali

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con basi con cui vengono a contatto; es. eosina colorano citoplasma e proteine), basici (auxocromo

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costituito da gruppo amminico e suoi derivati o metalli nelle lacche; es. ematossilina colorano DNA, RNA)

e neutri (es. eosinato di blu di metilene). Il principale tipo di legame tra colorante e substrato è quello

ionico. Lacche: classe particolare di coloranti basici in cui l’auxocromo è un metallo (alluminio, ferro,

cromo). Modalità di esecuzione della colorazione: in blocco (pre-sezionamento), su sezioni di tessuto (post-

sezionamento), dirette (senza pretrattamento), indirette (preceduta da mordenzatura). Mordenzatura:

consiste nel trattare il tessuto con un composto (mordente es. acido cromico, a. picrico, a. citrico, iodio

ecc.) capace di fissare su di esso dei gruppi acidi o basici, i quali si legheranno al colorante. Classificazione

colorante in base a tempo di trattamento e sua concentrazione: progressive (intensità in funzione del

tempo; processo di colorazione arrestato quando il preparato ha raggiunto il colore desiderato), regressive

(agiscono in modo intenso; occorre rimuovere il colorante in eccesso dalla sezione; il preparato e

sovracolorato e poi decolorato). A seconda del colorante: semplici (1 solo colorante), complesse (più

coloranti). La colorazione avviene solo con meccanismi fisici per solubilità del colorante in alcuni comparti

tissutali o per diffusione del colorante nelle lacune del tessuto o per imbibizione, ovvero precipitazione dei

metalli sulle strutture del tessuto. La reazione fra colorante e substrato avviene attraverso legami chimici

specifici in 2 modi: assorbimento elettrico (attrazione elettrostatica tra carica del colorante e carica del

substrato) e assorbimento superficiale (tensione superficiale tra colorante e substrato). Metodo di

trasmissione del colore: c. ortocromatica (più frequente; colorante che imprime al tessuto il suo colore), c.

policromatica (con uso di coloranti differenti si ottiene un tessuto con colori differenti), c. metacromatica

(colorante basico es. blu di metilene conferisce al tessuto colori differenti a seconda delle circostanze; solo

alcuni componenti tissutali presentano queste caratteristiche: cromotropi es. matrice cartilagine).

Colorazioni di routine (usate come prima indagine, per far vedere principali strutture istologiche):

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Ematossilina-eosina colorazione bicromica più usata in istologia. L’ematossilina (o meglio il suo

prodotto di ossidazione l’emateina) è un colorante basico che colora i nuclei di blu-viola. L’eosina è

un colorante debolmente acido che colora di rosa-rosso il citoplasma e il connettivo. L’emateina

costituisce il cromoforo. Per conferire al composto carica positiva e renderla più affine per i tessuti

è necessario aggiungere un mordente che fa da auxocromo (es. allume potassico) e che costituirà

con l’emateina una lacca insolubile: l’emallume. A seconda del mordente utilizzato si distinguono

varie ematossiline, le più utilizzate sono: e. di mayer, e. di harris, e. di gill.

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Papanicolau colorazione più usata per la citologia, poiché adatta a mettere in evidenza anomalie

nucleari, citoplasmatiche, morfologiche. Il nucleo di colora di blu con ematossilina di harris; il

citoplasma viene colorato con miscela policroma formata da: eosina, verde luce, acido

fosfotungstico e orange.

➢ Coloranti per fibre di tessuto connettivo (cellule separ