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mezzo e un reagente antifade (una grossa componente del photobleaching può essere attribuita alla

generazione di radicali liberi durante la fase di eccitazione del fluoroforo; l’utilizzo di molecole scavenger

diminuisce il tasso di photobleaching).

L’acquisizione di buone immagini in microscopia confocale richiede una buona tecnica di preparazione del campione.

La qualità nella preparazione del campione prevede attenzione nella scelta e nell’applicazione dei protocolli.

IMMUNOFLUORESCENZA E FISH.

L’immunofluorescenza è una tecnica che consente di rivelare la presenza di una proteina (antigene) presente su

cellule o tessuti, sfruttando la capacità di riconoscimento dell’antigene da parte di un anticorpo specifico. Consente

di caratterizzare il fenotipo cellulare mediante identificazione di proteine di membrana o intracellulari e di antigeni

tumorali. Può essere applicata a campioni citologici (in adesione o in sospensione) e istologici (tessuti paraffinati o

congelati). Sistemi di rivelazione: metodo diretto (l’anticorpo primario coniugato con u marcatore si lega all’antigene

e viene localizzato da un opportuno sistema di rivelazione) e indiretto (anticorpo primario si lega all’antigene, un

anticorpo secondario marcato si lega all’anticorpo primario). Il legame antigene anticorpo viene rivelato grazie

all’emissione fluorescente di un fluorocromo coniugato all’anticorpo. Per la controcolorazione vengono usati

coloranti nucleari e la reazione viene seguita al microscopio a fluorescenza. L’impiego di due differenti anticorpi

marcati con ficoeritrina e fluoresceina isotiocianato consente di evidenziare contemporaneamente due differenti

anticorpi sullo stesso preparato. 

Tecniche di immunofluorescenza vantaggi: facilità e velocità di esecuzione, ampia disponibilità reattivi, possibilità

di combinare più colorazioni; svantaggi: estinzione fluorescenza nel tempo, ridotta sensibilità.

Tecniche immunoenzimatiche vantaggi: colorazione permanente, aumentata sensibilità, possibilità di combinare

più colorazioni, possibilità di amplificare il segnale; svantaggi: substrati cancerosi, metodica laboriosa.

Controlli assicurano l’accuratezza dei risultati e la specificità della reazione.

➢ C. dei reagenti: sostituire l’anticorpo primario con siero non immune o con tampone di diluizione per

assicurarsi che la marcatura sia il risultato del legame specifico tra anticorpo e antigene; omettere

l’anticorpo primario e secondario per verificare la presenza di autofluorescenza.

➢ C. dei controlli: c. positivo (inserire campione che esprime l’antigene ricercato), c. negativo (inserire

campione che non esprime l’antigene ricercato), controllo interno (inserire campione dello stesso tipo già

testato precedentemente per l’antigene ricercato).

Specificità dell’anticorpo secondario se l’anticorpo secondario cross reagisce con le immunoglobuline del tessuto

gli anticorpi vengono assorbiti è utile nel caso di marcatura multipla. Escludere i fluorocromi che hanno

l’emissione simile a quella dell’eventuale autofluorescenza del campione, Scegliere i fluorocromi con foto bleaching

ridotto.

Se il segnale dato dal legame antigene-anticorpo è debole: aumentare la concentrazione dell’anticorpo, variare

tempi e temperature di incubazione dell’antigene, utilizzare un detergente di membrana, applicare procedure di

smascheramento antigenico.

Protocollo reazione immunoenzimatica: 1) fissazione; 2) inibizione enzimi endogeni; 3) blocco reazioni non specifiche

con soluzione proteica; 4) anticorpo primario; 5) anticorpo secondario-fluorocromo.

Tecniche diagnostiche immunologiche applicate alla biopsia renale (“frustolo”).

La biopsia permette una diagnosi corretta nella maggior parte dei casi di malattie renali diffuse.

Microscopia ottica fissazione del tessuto renale in liquido di Dubosq-Brazil o formalina tamponata al 10% e

successiva inclusione in paraffina; taglio al microtomo di sezioni con spessore 2-5mm; colorazioni con ematossilina-

eosina, PAS, acido periodico e argento-metenamina, tricromica di masson, rosso Congo, ematossilina fosfotungstica.

La m. ottica può dare informazioni su: lesioni glomerulari, lesioni tubulari, alterazioni dell’interstizio, alterazioni dei

vasi. 

Microscopia elettronica fissazione del frammento renale in gluteraldeide (2,5%), quindi in acido osmico e

successiva inclusione in epon. La m. elettronica dà informazioni su alterazioni minime delle cellule delle strutture

glomerulari non individuabili con la microscopia ottica ordinaria. Permette la visualizzazione di materiale omogeneo

derivante dalla deposizione di anticorpi e complemento e di costituenti degradati delle strutture glomerulari.

Immunofluorescenza per individuare la presenza e la localizzazione delle immunoglobuline e le frazioni del

complemento: indicano la natura immunitaria del processo patogenetico di una glomerulopatia. Allestimento sezioni

di tessuto per immunofluorescenza: 1) immersione del frustolo in soluzione fisiologica o deposizione su di una garza

imbevuta di fisiologica; 2) inclusione con un particolare gel fornito dal commercio e congelati (per conferire rigidità al

tessuto, per stabilizzare le strutture cellulari e per mantenere inalterate le caratteristiche antigeniche del tessuto) in

azoto liquido; 3) blocchetto conservato a -80°C fino al momento del taglio; 4) taglio al criostato permette di ottenere

sezioni dello spessore di 5mm che saranno applicate su vetrini portaoggetto. Metodica immunofluorescenza

(diretta): tessuto asciugato, lavaggio con soluzione fisiologica, fissazione in acetone, applicazione antisiero

fluoresceinato contenente anticorpi diretti contro l’antigene del quale si va alla ricerca nel preparato microscopico,

tre lavaggi con soluzione fisiologica per eliminare l’antisiero e la fluoresceina in eccesso. Lettura del preparato: con

microscopio a fluorescenza, si può osservare sulle diverse strutture che compongono il tessuto a livello dei glomeruli,

tubuli, nell’interstizio e vasi. La distribuzione può essere diffusa oppure focale (interessa solo un certo numero di

glomeruli o tubuli). La distribuzione a livello del glomerulo può essere globale oppure segmentaria (interessa solo

una parte delle anse totali del glomerulo). Depositi di immunoglobuline: localizzazione (a livello mesangiale,

parietale e capsulare del glomerulo, nella membrana basale del tubulo, nell’intima o nella media del vaso, nelle

cellule o nello stroma dell’interstizio) e aspetto (granulare o lineare). Refertazione e archiviazione: dopo aver

esaminato le lesioni presenti nel campione bioptico ed averle annotate sul modulo di refertazione, il patologo dovrà

annotarvi la sua diagnosi (diagnosi istologica in quanto in una biopsia renale vi sono ben poche lesioni caratteristiche

di una precisa malattia). La biopsia renale viene osservata al microscopio confocale a scansione laser in grado di

catturare il segnale fluorescente e trasformarlo in un segnale elettrico che produce un’immagine sullo schermo. Le

immagini diventano dei file che vengono immagazzinati nel PC.

Fish.

FISH (ibridazione fluorescenza in situ) è una tecnica citogenetica utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o

l'assenza di sequenze di DNA specifiche sui cromosomi. Utilizza sonde fluorescenti che si legano solo a quelle parti

del cromosoma con cui mostrano un elevato grado di complementarità di sequenza. La microscopia a fluorescenza

può essere utilizzata per scoprire dove la sonda fluorescente è legata ai cromosomi. La FISH è spesso utilizzata per

individuare caratteristiche specifiche del DNA e per localizzare target specifici di RNA nelle cellule. In questo

contesto, può aiutare a definire gli schemi spaziali-temporali dell'espressione genica all'interno di cellule e tessuti.

Gli elementi di base della FISH sono una sonda DNA e una sequenza target. Prima dell'ibridazione, la sonda del DNA

è marcata con vari mezzi, come la nick translation, la marcatura casuale e la PCR. Sono comunemente utilizzate due

strategie di marcatura: marcatura indiretta (le sonde sono marcate con nucleotidi modificati che contengono un

aptene; il segnale è determinato dall'interazione di biotina o digossigenina legate ad un nucleotide sempre della

sonda, con substrati legati direttamente ad un fluorocromo) e marcatura diretta (utilizza nucleotidi che sono stati

direttamente modificati per contenere un fluoroforo). La sonda marcata e il DNA target sono denaturati. La

combinazione della sonda denaturata e della sequenza target consente l’annealing di sequenze complementari di

DNA. Se la sonda è stata marcata indirettamente, è necessario un passaggio supplementare per la visualizzazione

dell’aptene nonfluorescente che utilizza un sistema di rilevazione enzimatico o immunologico. Mentre la FISH è più

veloce con sonde marcate direttamente, la marcatura indiretta offre il vantaggio dell'ampliamento del segnale

utilizzando diversi livelli di anticorpi e potrebbe quindi produrre un segnale più luminoso rispetto ai livelli di

background.

La FISH è importante nella diagnosi clinica di diverse anomalie cromosomiche (delezioni, duplicazioni e traslocazioni).

L'interphase FISH può essere utilizzata per diagnosticare le anomalie dei cromosomi (es. la CMT tipo 1°: condizione

neurologica causata da una duplicazione in un gene sul cromosoma 17 che codifica una delle proteine della guaina

mielinica). 

QuantiGene ViewRNA ISH sonde metodo per la rilevazione e la quantificazione di mRNA e molecole di miRNA nei

campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina, freschi o congelati, nei campioni di cellule e nelle cellule

tumorali circolanti (CTC). 

Sonde Stellaris (R) RNA FISH metodo per rilevare e quantificare mRNA e altre molecole lunghe di RNA in uno

strato sottile di campione di tessuto. I singoli campioni di RNA FISH possono essere eseguiti in simplex o multiplex e

possono essere utilizzati come esperimenti di follow-up per PCR quantitativo o immaginati simultaneamente con un

test anticorpale in fluorescenza. Ha applicazioni nella diagnosi del cancro, nella neuroscienza, nell'analisi

dell’espressione genica e nella diagnostica di accompagnamento.

Geni e neoplasie della mammella: recettore dell’estrogeno (ERs), recettore del progesterone (PRs), p53, BRCA1-

BRCA2, HER2. HER2 è un proto-oncogene situato nel braccio lungo del cromosoma 17, non è solo un fattore

prognostico, ma è anche un fattore predittivo alla risposta al farmaco, quindi un paziente con alta espressione di

HER2 verrà sottoposto al trattamento con questo farmaco. La sua iperespressione = 20% casi di tumore mammario.

Valutazione:

➢ 0 cellule colorate.

➢ 1+, rarissime cellule colorate solo sul contorno (no amplificazione, quindi non verrà dato farmaco).

➢ 2+, situazione intermedia con circa il 10% di cellule colorate; situazione dubbia (rivalutati con un’altra

metodica FISH).

➢ 3+ molte cellule colorate (si amplificazione, quindi verrà dato farmaco Herceptin).

Vysis e Dakocytomation permettono di valutare l’amplificazione del gene HER2 mediante FISH. Prevedono l’uso di

2 sonde marcate con sostanze fluorescenti: HER-2 che identifica l’intero gene marcato con Spectrum Orange e CEP-

17 che si ibridizza con il DINA alfa-satellite localizzato nel centromero del cromosoma 17, marcato con Spectrum

Green. Se la situazione è di normalità si avranno due puntini rossi e due verdi (2 cromosomi e 2 geni). Se invece si ha

aumento delle copie del gene, ho moltissimi puntini rossi, quindi la situazione è di amplificazione e la paziente deve

essere sottoposta alla terapia farmacologica. Valutazione: amplificazione > 2,2; non amplificato < 1,8.

Aspetto metodologico: 1) fissazione; 2) taglio; 3) pretrattamento; 4) digestione enzimatica; 5) co-denaturazione DNA

campione/DNA sonda; 6) ibridazione; 7) lavaggi di stringenza; 8) controcolorazione/montaggio.

MICROSCOPIA CONFOCALE.

M. a fluorescenza: non permette di eccitare in modo distinto due o più fluorocromi presenti contemporaneamente

nel preparato o di ottenere informazioni da piani discreti del preparato (l’immagine riprodotta corrisponde alla

sovrapposizione degli elementi presenti lungo l’intero asse z, ovvero la profondità del campione, del campo

osservato.

Il m. confocale è costituito da un fotomoltiplicatore (detector), un pinhole (permette di selezionare il fuoco relativo

ad una sezione del preparato), un laser (permette di eccitare in modo specifico un dato fluorocromo), un beam

splitter, uno scanner, un obiettivo.

Per ottenere una perfetta rappresentazione di un singolo piano del campione, si dovrebbe idealmente raccogliere

soltanto la luce proveniente da quel particolare piano; poiché tuttavia, anche i piani sovrastanti e sottostanti

emettono luce, vi è una perdita di nitidezza dell’immagine. La chiave del successo della tecnica confocale consiste

nella rimozione delle interferenze provenienti dai piani adiacenti a quello ove si è focalizzati, mediante l’uso del

cosiddetto pinhole. La microscopia confocale usa, per eccitare le molecole, una sorgente luminosa molto intensa, il

laser. La luce emessa dai fluorocromi eccitati dal laser viene catturata dalle lenti dell’obiettivo, attraversa lo specchio

dicroico e raggiunge il fotomoltiplicatore, che trasforma l’intensità luminosa in un segnale elettrico di intensità

proporzionale. Tra lo specchio dicroico ed il fotomoltiplicatore, il fascio luminoso attraversa un diaframma, o

pinhole, che impedisce alla luce proveniente dalle zone fuori fuoco di raggiungere il fotomoltiplicatore. In questo

modo solo il segnale luminoso relativo al piano di fuoco viene registrato e utilizzato nella formazione dell’immagine

finale. Il risultato è un’immagine poco disturbata dalla diffusione della luce delle zone non a fuoco. Per ottenere la

rappresentazione non di una porzione microscopica del campione ma di un intero piano, si muove il fascio di luce

lungo il campione di punto in punto, in modo che tutto il piano situato alla profondità voluta venga illuminata dal

fascio di luce secondo una precisa sequenza. Questo processo viene detto scansione. Il segnale elettrico in uscita dal

fotomoltiplicatore viene quindi digitalizzato ed inviato ad un computer che registra i valori di intensità misurati per

ogni punto. Questi valori vengono utilizzati per ricostruire l’immagine: ogni punto corrisponde ad un pixel dello

schermo, e l’intensità luminosa del punto verrà rappresentata da una corrispondente tonalità di grigio.

L’accostamento di tutti i singoli pixel corrispondenti a punti scanditi dal fascio laser nel campione darà così

l’immagine finale.

Lo spessore “piano z” analizzato al microscopio confocale è direttamente proporzionale all’apertura del pinhole,

 

tuttavia non è possibile ridurla oltre certi limiti spessore minimo valutabile: 0,6 – 1,2 µm 1 Airy unit: migliore

compromesso tra chiusura del pinhole e entità della diffrazione generata e luminosità dell’immagine ottenuta.

Utilizzando questo microscopio vi è la possibilità di scansionare sequenzialmente il campione per una ricostruzione

tridimensionale.

Colocalizzazione di antigeni: a livello del fotomoltiplicatore viene riprodotta l’immagine del campione analizzato, se

ad uno stesso pixel arriva la radiazione luminosa proveniente da due diversi fluorocromi, il colore registrato dal pixel

stesso deriverà dalla “fusione” dei colori appartenenti ai fluorocromi in esame. Tuttavia affinché ciò accada (e non vi

sia la sovrapposizione delle molecole) è indispensabile che venga analizzato un singolo piano focale.

Vantaggi del m. confocale:

1) E’ possibile rilevare più differenze di colore.

2) Minor cross talk: nella maggior parte delle applicazioni, i fluorocromi hanno spettri di emissione sovrapposti.

Quindi, i segnali di emissione non possono essere separati completamente in diversi canali di rilevazione che

hanno come conseguenza il cross talk. Tuttavia, se i fluorocromi hanno spettri di eccitazione distinti, possono

essere eccitati sequenzialmente usando una lunghezza d'onda di eccitazione alla volta. Ciò è possibile solo

con i sistemi confocali che offrono la funzionalità multitracking.

3) Scansione laser: è uno strumento potente per generare immagini ad alta risoluzione e ricostruzioni 3D di un

campione. [Il laser viene focalizzato dall'obiettivo sul campione, quindi arriva in un solo punto del campione.

Nonostante si abbia comunque bleaching sull'asse z, non avrai bleaching nelle zone che non stai guardando.

D'altra parte la luce del laser è generalmente più forte quindi nella zona dove stai osservando il bleaching è

molto più forte.]

4) Ricostruzione tridimensionale del campione.

Applicazioni: colocalizzazione (es. delle proteine), imaging di cellule vive FRAP/FLIP (photobleaching), GFP-fusion,

FRET (trasferimento non radioattivo dell'energia fotonica da un fluoroforo eccitato donatore ad un altro fluoroforo

accettore quando entrambi si trovano in prossimità al fine di risolvere la vicinanza reale delle molecole al di là del

limite ottico di un microscopio leggero). 

Svantaggi: bassa profondità di penetrazione della luce, bleaching (sbiancamento perdita di fluorescenza del

campione dopo che sta troppo tempo sotto la luce del microscopio).

Nella fluorescenza convenzionale un fotone ad alta energia eccita un fluoroforo al punto che emette un fotone di

energia inferiore. Nell’eccitazione multi-fotonica le energie combinate di due o più fotoni con lunghezza d'onda

lunga producono l'emissione di un singolo fotone di energia superiore. La densità del fotone richiesta per

l'eccitazione di due fotoni può essere stabilita solo nel piano focale e all'interno di un impulso laser.

Microscopio a due fotoni: permette di focalizzarsi su regioni più in profondità nel campione e di generare

pochissimo bleaching. Per generare un segnale sufficiente la luce di eccitazione deve essere molto intensa. Pertanto,

vengono usati laser a pulsazione che emettono pulsazioni ultrashort con intensità di picco elevate. L'utilizzo di un

laser pulsato mantiene anche il potere medio relativamente basso, meno dannoso per il campione.

Vantaggi: 1) riduzione della perdita di luce, consentendo così l'imaging di strutture in profondità all'interno di un

blocco di tessuti; 2) l'eccitazione può avvenire solo nel piano focale pertanto è evitato il bleaching fuori fuoco; 3)

fototossicità inferiore a causa delle lunghezze d'onda più lunghe utilizzate. Pertanto, la microscopia multifotonica

consente tempi di imaging più lunghi.

TECNICHE ULTRASTRUTTURALI. 

Microscopio ottico: potere di risoluzione 0,25x10^-3 mm (occhio umano 0,25 mm massimo ingrandimento utile è

di circa 1000 volte). Unità di misura è il micron (µm = 10^-3 mm).

Microscopia elettronica: impiega come sorgente di illuminazione gli elettroni in modo da avere una risoluzione

superiore di circa un migliaio di volte rispetto al MO. L’unità di misura è il nanometro (nm = 10^-6 mm) o l’amstrong

(10^-7 mm). Potere di risoluzione: 0,25 nm (2,5 amstrong). Tuttavia in campo biomedico le procedure tecniche di

allestimento dei preparati non permettono la conservazione di dettagli di dimensioni < di 2 nm.

Emissione elettronica: produzione nel vuoto di elettroni liberi. 3 tipi: e. termoionica (provocata dal riscaldamento di

un metallo o di un suo sale), e. di campo o elettrostatica (ottenuta per azione di intensi campi magnetici), e.

secondaria (provocata dall’azione di elettroni ad elevata energia su di una superficie appropriata).

3 tipi mi microscopi elettronici:

➢ M.E. a trasmissione (TEM): permette di ottenere immagini bidimensionali relative alla struttura interna del

campione (valutazione della microanatomia dei tessuti biologici). Un fascio elettronico generato da un

catodo viene focalizzato da lenti elettromagnetiche (condensatori) su un campione sottile (sezioni ultra fini

di 60-90 nm); il fascio interagisce col campione, lo attraversa e produce un’immagine nel piano focale

posteriore di un’altra lente (obiettivo) posta sotto il piano oggetto. L’immagine viene ulteriormente

ingrandita da un insieme di altre lenti e visualizzata su uno schermo fluorescente posto alla fine dell’intero

complesso.

Scattering (diffusione): quando un fascio elettronico attraversa un campione gli atomi di quest’ultimo

possono interagire con gli elettroni incidenti. Si possono avere 3 possibilità: 1) l’elettrone non colpisce

l’atomo (elettrone unscattered); 2) l’elettrone colpisce il nucleo dell’atomo (scattering elastico: assente

perdita di energia, non contribuisce alla formazione dell’immagine); 3) l’elettrone colpisce un elettrone

orbitale dell’atomo (scattering inelastico: perdita di energia, contribuisce alla formazione dell’immagine).

➢ M.E. a scansione (SEM): permette di ottenere immagini di aspetto tridimensionale, relative alla topografia di

superficie di un campione utilizzando un fascio elettronico opportunamente deflesso. Gli elettroni secondari

emessi dalla superficie del campione vengono raccolti e il segnale risultante impiegato per formare in

un’immagine sequenziale sullo schermo di un tubo a raggi catodici.

Elettroni secondari: l’interazione del fascio elettronico con gli elettroni degli orbitali esterni degli atomi del

preparato provoca l’allontanamento degli stessi elettroni di valenza. L’elettrone espulso (elettrone

secondario) ha un’energia compresa tra 0 e 50 eV la possibilità di emergere dalla superficie del campione se

il fenomeno che lo ha generato è avvenuto a profondità non superiori a 10 nm.

Elettroni retrodiffusi (BSE): generati da fenomeni di diffusione elastica fra elettrone incidente e nucleo

dell’atomo bombardato. Si ha quando l’angolo di diffusione supera i 90°; in questo caso l’energia

dell’elettrone emergente è simile a quella dell’elettrone incidente, se l’evento è avvenuto in zone

superficiali, ed è sempre superiore a 50 eV. Forniscono informazioni di tipo composito o morfologico relative

a zone del campione profonde alcuni micron.

Catodoluminescenza: radiazione luminosa che determinate molecole emettono a seguito dell’interazione

con un fascio elettronico ad elevata energia. Si basa sulla conversione di una piccola quota di energia

incidente in radiazioni elettromagnetiche nel campo del visibile. Lo spettro di emissione consente di

identificare la sostanza che presenta tale proprietà.

Radiazioni x: quando un atomo viene colpito da un elettrone di energia sufficientemente elevata può

avvenire che un elettrone degli strati più interni venga espulso originando una lacuna. Un elettrone di uno

strato più esterno va ad occupare la lacuna con conseguente rilascio di energia. Questa energia può essere

emessa in forma radioattiva come onda elettromagnetica (emissione di raggi x).

Altri tipi di segnali generati dall’interazione tra il fascio elettronico e il campione: corrente di campione,

elettroni Auger, contrasti magnetici ecc.

➢ M.E. a scansione in trasmissione (STEM).

TEM

Allestimento dei preparati. 

TEM: prelievo, stabilizzazione, disidratazione, inclusione, sezionamento, contrastazione, ricopertura. Procedure

che hanno lo scopo di ottenere un blocco sezionabile la cui ultrastruttura sia preservata col minimo delle alterazioni.

SEM: prelievo, stabilizzazione, disidratazione, essicamento, montaggio, ricopertura.

Prelievo:

➢ Biopsia incisionale: asportazione di minimi frammenti di lesione oppure dell’intera lesione senza

asportazione dei tessuti circostanti la lesione.

❖ Biopsia Punch: si effettua con lama ellittica rotante e rimuove un pezzo cilindrico di tessuto. Si

utilizza in caso di lesioni piccole, infiammatorie o infiltrative, in caso di necessità di biopsie multiple.

Controindicata in caso di lesioni superficiali e troppo profonde.

❖ B. Shave: utilizzata per evitare cicatrici. Le lesioni sporgenti, benigne, vengono asportate

tangenzialmente alla superficie cutanea in corrispondenza della loro base. Si utilizza in caso di lesioni

superficiali e/o esofitiche. Nel caso di lesioni superficiali permette l’esportazione totale della

patologia; in caso di lesioni profonde comporta l’asportazione parziale della lesione.

❖ Frammento di lesione: asportazione di una piccola porzione della lesione. E’ indicato nel caso di

lesioni benigne estese, lesioni sospette estese, localizzazione chirurgica critica, condizioni non

ottimali. Se le lesioni sono multiple è meglio scegliere la più recente e comprendere nel frammento

anche parte di tessuto sano.

➢ Biopsia escissionale: lo scopo è ottenere un campione per l’esame istologico e rimuovere interamente la

lesione. A seconda del sospetto clinico, dovranno essere più o meno ampi i margini di tessuto sano che

circondano la lesione e la profondità dell’incisione stessa. Di solito si pratica con il bisturi un’incisione di

forma ellittica; ma si possono praticare anche altri 2 tipi di incisioni: e. a cuneo (utilizzata quando la lesione si

trova intorno ad un orifizio naturale e si deve salvaguardare la funzionalità della zona es. labbra, palpebre,

padiglioni auricolari) ed e. circolare (utilizzata in particolari sedi anatomiche dove risulta difficile praticare

altri tipi di incisioni es. ala del naso).

Minime dimensioni (0,5-1 mm^3) che permettano il mantenimento delle interrelazioni ultrastrutturali e l’esecuzione

ottimale delle tecniche di allestimento.

Stabilizzazione:

Immobilizzazione istantanea di tutti i componenti della cellula in modo da preservare i rapporti submicroscopici. Il

fissativo ideale dovrebbe avere lo stesso pH, osmolarità e costituzione ionica del tessuto. Un liquido fissativo è

composto da un agente fissante e un veicolo (liquido tampone). I fissativi per MO non sono ottimali per ME. I

principali tamponi utilizzati sono: tamponi fosfato (i più fisiologici ed innocui, il pH cambia poco con la temperatura,

stabili, tuttavia danno precipitati e si contaminano facilmente con microrganismi), tamponi cacodilato (tossici,

generalmente usati in miscele a base di glutaraldeide per fissazione primaria, sono facilmente preparabili, non

vengono contaminati da microrganismi, sono stabili), tampone veronal acetato (utilizzato solo per fissazione

secondaria, non viene utilizzato con le aldeidi). In genere i fissativi ipertonici danno meno artefatti rispetto a quelli

ipotonici. Si può modificare l’osmolarità del fissativo agendo sulla concentrazione dei sali del tampone. La metodica

di fissazione più usata prevede 2 tempi: fissazione primaria con aldeidi e fissazione secondaria con tetrossido di

osmio. La paraformaldeide è un buon fissativo per la ME; reagisce lentamente e in modo reversibile con proteine e

lipidi (non con polisaccaridi); ha velocità di penetrazione elevata. La glutaraldeide conserva bene la matrice

extracellulare e la sostanza fondamentale; non preserva i lipidi; reticola le proteine. Il tetrossido di osmio è tossico e

nocivo per le mucose; eccellente per la post-fissazione perché stabilizza i lipidi; come fissativo primario provoca la

perdita dei lipidi. Anche la miscela di Karnovsky (paraformaldeide + glutaraldeide) è un fissativo molto usato. In

alcuni laboratori si utilizza una terza fissazione con acetato di uranile in soluzione alcolica, da effettuare prima o

dopo la disidratazione.  

Fissazione con glutaraldeide in tampone cacodilato lavaggio in tampone cacodilato post-fissazione con

tetrossido di osmio in tampone cacodilato lavaggio con tampone cacodilato.

Disidratazione:

Effettuata con etanolo o acetone il più brevemente possibile ed in modo graduale, attraverso l’impiego di soluzioni a

concentrazione crescente di solvente in acqua.

Inclusione:

Prevede una graduale sostituzione del disidratante col medium di inclusione. Viene effettuata con soluzioni a

concentrazione crescente di resina nel solvente stesso fino ad arrivare ad un ultimo passaggio in una miscela di

resina pura. Le resine attualmente utilizzate sono resine acriliche (es. glicol metacrilato; utilizzate per metodi di

immunoistochimica in post-embedding) e resine epossidiche (per studi di morfologia ultrastrutturale). Vengono

utilizzate miscele di monomeri epossidici mescolati a particolari liquidi indurenti costituiti da anidridi organiche. I

catalizzatori (acceleratori) impiegati sono composti di tipo amminico. Gli epossidi liquidi sono solubili in acetone ma

non in etanolo, per cui se si usa etanolo per la disidratazione si deve ricorrere a un solvente intermedio (ossido di

propilene). Realizzata l’impregnazione i frammenti devono essere trasferiti in una capsula (capsule beem) di

materiale inerte (polietilene o gelatina) contenente la miscela di inclusione. La polimerizzazione a caldo sarà

effettuata facendo stazionare tali contenitori in stufa a 60° per un tempo variabile. I blocchetti così ottenuti

potranno, dopo aver rimosso la capsula, essere spiramidati e sezionati.

Sezionamento:

Viene effettuato mediante l’impiego di ultramicrotomi. Il campione, sistemato all’estremità di un braccio mobile,

viene fatto passare ritmicamente dall’alto verso il basso in corrispondenza di una lama di cristallo o di diamante

fissata ad un supporto, allo scopo di ottenere il sezionamento. Le sezioni prodotte vengono raccolte sulla superficie

di un liquido (acqua distillata) contenuto all’interno di una vaschetta. A seconda dello spessore delle sezioni

possiamo distinguere: sezioni semifini (0,5-2 µm) e ultrafini (40 nm-0,5 µm).

Allineamento del campione alla lama: esaminando al binoculare il campo di sezionamento, è possibile osservare, in

luce focalizzata, l’immagine speculare del filo della lama riflessa sulla faccia del preparato.

Raccolta delle sezioni: le sezioni vengono trasferite dalla vaschetta in una goccia d’acqua depositata sopra a un

vetrino. Vengono in seguito fatte aderire al vetrino tramite riscaldamento dello stesso sopra una piastra riscaldata.

Per il sezionamento ultrafine: la faccia di sezionamento ottenuta preliminarmente viene ulteriormente ridotta in

superficie, delimitando la zona di interesse per il sezionamento. Usando un utensile provvisto di un capello

nell’estremità, si divide il nastrino di sezioni; le parti ottenute vengono fatte aderire a una parete della vaschetta. Le

sezioni vengono raccolte attraverso un retino che viene fatto immergere. La pellicola di supporto è costituita da

Formvar disciolto in cloroformio (preparazione: stecca di vetro immersa in soluzione di formvar-cloroformio, viene

asciugata, incisa sui lati e viene fatta flottare su una superficie acquosa; dopo aver depositato i retini sulla pellicola,

questa viene sollevata dall’acqua con l’impiego di una striscia di parafilm).

Colorazione:

Le sezioni vengono distese su piastra riscaldata e poi vengono raffreddate a temperatura ambiente. La colorazione

del vetrino avviene su piastra riscaldata. Si effettua un lavaggio del vetrino con acqua distillata e si asciuga su piastra

riscaldata.

Contrastazione:

Per poter ottenere un sufficiente contrasto è necessario incrementare artificialmente lo scarso potere di scattering

atomico mostrato dal materiale biologico. A tal fine il campione viene sottoposto ad un processo di contrastazione

elettronica attraverso l’applicazione di soluzioni saline di elementi ad elevato numero atomico (sali di uranio e sali di

piombo).

Ricopertura:

Metodica facoltativa volta a depositare sul retino una sottile pellicola di carbonio evaporato mediante l’uso di un

evaporatore al fine di aumentare la stabilità e la resistenza del campione quando viene sottoposto all’azione del

fascio elettronico.

Immunomicroscopia elettronica:

L’immunoistochimica appresenta la più specifica e sensibile metodica di evidenziazione di strutture

submicroscopiche. La localizzazione specifica dei costituenti cellulari richiedi che essi abbiano caratteristiche

antigeniche in modo da reagire con i relativi anticorpi. Per la visualizzazione dell’avvenuta reazione antigene-

anticorpo è necessario che l’anticorpo sia coniugato con particelle elettrondense (oro colloidale marcatore più

utilizzato; consente studi con doppia o multipla marcatura per la contemporanea localizzazione nello stesso

preparato di due o più determinanti antigenici). La reazione immunoistochimica può essere effettuata sia prima

dell’inclusione (pre-embedding) che dopo (post-embedding).

Tecniche.

Tecnica di replicazione: utilizzata allo scopo di poter osservare al TEM la superficie di campioni elettrondensi.

Consiste nella produzione di una pellicola (di platino) di ricopertura della superficie del campione, nel distacco della

replica così ottenuta, nella sua pulizia e nel montaggio di questa sopra un retino di osservazione. La ricopertura può

essere effettuata direttamente sul campione (single stage procedure) oppure ricoprendola prima con una pellicola

plastica ed effettuando l’evaporazione sullo stampo ottenuto (double stage procedure).

Freeze Fracturing and Etching: tecnica importante per lo studio delle membrane cellulari. E’ composta da tre fasi: 1)

trattamento crioprotettivo e congelamento del campione; 2) introduzione del campione congelato dentro un’unità

da vuoto, fratturazione dello stesso con una lama raffreddata e ricopertura della frattura con un film di platino; 3)

distacco del campione dalla replica ottenuta, pulizia della stessa e raccolta sopra un retino da osservazione.

Shadow Casting (ombreggiatura): consiste nell’effettuare una deposizione di materiale elettrondenso (cromo, oro,

platino) sulla superficie dei campioni. La loro evaporazione consente di visualizzare col TEM dei preparati liberi

ricoperti dal film di deposizione ottenuto. Questa tecnica, sviluppata per per lo studio di batteri e virus, è stata

sostituita dalla colorazione negativa.

Colorazione negativa: si basa sull’interazione tra la superficie esterna di microrganismi e sostanze formate da atomi

pesanti ed opachi agli elettroni. Ciò permette di visualizzare al TEM dettagli sulla superficie delle particelle che

appaiono chiare su sfondo scuro. I coloranti più usati sono: sodio tungstato, acido fosfotungstico, acetato di uranile.

Su una griglia si pone una goccia di sospensione e alcune gocce di colorante.

SEM

Osservazione mediante elettroni secondari.

Prelievo e Stabilizzazione uguale a TEM.

Disidratazione:

Ha lo scopo di togliere i liquidi presenti nel tessuto. Dopo aver sostituito il fissativo con soluzioni a concentrazione

crescente di solvente (etanolo o acetone) in acqua, queste ultime vengono allontanate con l’essicamento.

Essicamento:

Non viene effettuato all’aria poiché potrebbe provocare coartazioni della superficie del campione.

➢ Freezing: trasformazione dei liquidi cellulari in fase solida tramite un rapidissimo raffreddamento,

permettendo di evitare le fasi di stabilizzazione e disidratazionee consentendo l’immediata osservazione del

campione.

➢ Freeze-Drying: sostituzione dell’acqua nel tessuto con un fluido refrigerante che viene rapidamente

congelato ed infine sublimato all’interno di un’unità di vuoto.

➢ Critical Point Drying: buona qualità dei risultati e metodo semplice e rapido; si basa sullo sfruttamento della

trasformazione in un’unica fase di fluido di un sistema liquido-vapore in equilibrio. Tale fenomeno, realizzato

in un’opportuna camera di reazione, avviene in assenza di forze di tensione superficiale. Si utilizza Co2

liquida.

Montaggio:

Consiste nel fissare il campione sul supporto di osservazione (stub). E’ una fase importante da un lato per garantire la

stabilità meccanica del preparato sotto l’azione del fascio di elettroni e dall’altro per assicurare la perfetta

conducibilità elettrica del campione nei confronti del supporto. Vengono utilizzati a questo scopo nastri bi-adesivi

e/o vernici metalliche conduttive.

Ricopertura (con film sottili di sostanze ad alto peso atomico es. oro, oro-palladio, platino):

Importante per incrementare la conducibilità termica ed elettrica del campione (riduzione disturbi) e l’emissione di

elettroni secondari (segnale forte e chiaro). Per ottenere la pellicola si utilizza lo strumento da vuoto sputtering

device.

Tecniche.

Criofrattura: il SEM permette lo studio di superfici molto più ampie rispetto a quelle valutabili con TEM. Il SEM

permette inoltre di utilizzare dopo e prima della criofrattura metodiche citochimiche, immunoistochimiche e di

macerazione cellulare e di poter localizzare le zone di avvenuta reazione con rivelatori compositi e analitici di segnale

(elettroni retrodiffusi, catodolumiscenza e raggi x) oltre agli elettroni secondari.

Macerazione: importante per esame dell’architettura tridimensionale. Si utilizzano soluzioni diluite di tetrossido di

osmio che consente, su materiale criofratturato, la rimozione delle proteine della matrice citoplasmatica e la

stabilizzazione delle proteine di membrana.

Esposizione del citoscheletro: per lo studio del citoscheletro sono necessarie metodiche che permettano la

solubilizzazione delle membrane plasmatiche e il mantenimento dei microfilamenti, dei microtubuli e dei filamenti

intermedi. Procedura: fissazione blanda, estrazione con detergente non ionico con tamponi stabilizzanti,

allestimento tradizionale.

Osservazione mediante elettroni retrodiffusi (BSE).

Permette di ottenere informazioni analitiche (non morfologiche di superficie) dal tessuto; consente di evidenziare

molecole o atomi di elevato peso atomico. Può permettere di localizzare i siti di reazione citochimici e/o

immunoistochimici che utilizzino metalli pesanti come rivelatori. Allestimento: fissazione solo aldeidica, montaggio

con paste adesive a base di carbonio, ricopertura con film sottile di carbonio.

Osservazione mediante catodoluminescenza.

Segnale poco utilizzato nella microscopia elettronica biomedica. In campo biologico i materiali dotati di

autoluminescenza sono pochi: depositi (licheni), zone di calcificazione, acidi nucleici. Composti in grado di generare

catodoluminescenza indotta: prodotti otticamente fosforescenti, reattivi della MO a fluorescenza. Le sostanze

catodoluminescenti vengono impiegate per mettere in evidenza zone di canalizzazione di alcuni preparati, rilevare

siti tissutali dotati di caratteristiche antigeniche. L’immagine è molto simile a quella da fluorescenza del MO.

Osservazione di microanalisi a raggi X.

Analizza la radiazione generata a seguito della ionizzazione degli atomi del campione. In un atomo pesante,

caratterizzato da numerosi orbitali, un evento ionizzante produrrà numerose transizioni e quindi un notevole

numero di emissioni X. La raccolta di tali radiazioni permette di discriminare i vari elementi contenuti nel campione.

Le regole per la preparazione del campione sono le stesse utilizzate per lo studio con elettroni secondari.

AUTOPSIA

E’ un esame medico post-mortem dettagliato del corpo e degli organi per stabilire cause, modalità, mezzi, momento

temporale della morte del soggetto. Può essere: completa, (cavità e testa), limitata (cavità) o selettiva (solo organi

specifici).

Può essere un’autopsia giudiziaria oppure un riscontro diagnostico. Quest’ultimo viene eseguito per accertare la

causa di morte (verifica della diagnosi formulata in vita), verifica diagnostica, chiarire quesiti clinico-scientifici,

evidenziare malattie infettive. L’autopsia inizia con un esame esterno del corpo, seguito dall’analisi delle alterazioni

degli organi (anatomiche ed istologiche), per concludere con l’epicrisi (giudizio conclusivo che si desume da una

somma di giudizi parziali) e con lo stabilimento della causa mortis.

Vantaggi:

➢ Per i medici curanti: stabilire le diagnosi finali (correlazione dei dati clinici con le alterazioni patologiche;

accuratezza della diagnosi), determinare la causa di morte (segnalazione dei casi di patologia infettiva,

riduzione del rischio di citazione in giudizio).

➢ Per i familiari: identificazione di malattie rare o contagiose, accettazione dell’evento mortale e rimozione di

sensi di colpa, diagnosi di malattia professionale.

➢ Per la Salute Pubblica: malattie contagiose o da tossici ambientali, analisi statistica delle cause di morte.

➢ Per l’educazione medica: conoscenza dell’anatomia normale e patologica, integrazione delle conoscenze

mediche di base con quelle cliniche.

➢ Per la ricerca medica: i dati ricavati sono essenziali per gli studi nell’ambito delle neuroscienze, delle malattie

cardiovascolari, dell’oncologia, dell’ematologia e della pneumologia; identificazione di patologie legate a

nuovi agenti infettivi o a patogeni ri-emergenti; identificazione di nuove patologie; valutazione degli effetti di

nuovi farmaci o dell’accuratezza di nuove tecniche di immagine.

Tecnica delle autopsie:

Il settore è alla destra del cadavere.

1) Si incidono cute e parti molli dal manubrio sternale seguendo una linea sagittale fino alla sinfisi pubica

passando a sinistra dell’ombelico.

2) Cute e parti molli vengono distaccati.

3) Si taglia l’inserzione clavicolare e sternale del muscolo sterno-cleido-mastoideo.

4) Con la punta della lama si penetra nell’articolazione sterno clavicolare e si procede alla disarticolazione (si

imprimono dei movimenti alla spalla per evidenziare l’articolazione).

5) Si tagliano le coste con il costotomo dal basso verso l’alto medialmente alla parte ossea della costa. Prima da

un lato poi dall’altro.

6) Si recidono le connessioni con il diaframma, pleure e connettivo mediastinico e si asporta il piastrone.

Esame di un organo: rapporti, forma, colore, volume-peso, consistenza, neoformazioni.

Esame del cuore:

1) Si apre e si esamina il sacco pericardico.

2) Si solleva il core dalla punta, si sezionano i grossi vasi e si asporta il cuore.

3) Si isolano e si esaminano le coronarie (coronaria sinistra: primo tratto è chiamato tronco comune, poi si

divide in 2 rami: arteria discendente anteriore e arteria circonflessa che decorre nella parete laterale del

ventricolo sinistro; coronaria destra: irrora il ventricolo destro e porta il sangue alle pareti inferiore e

posteriore del ventricolo sinistro).

4) Nel sospetto di embolia polmonare si asportano cuore e polmoni insieme.

Apertura del cuore:

1) Taglio trasversale sulla faccia anteriore lasciando la punta unita al resto del cuore. Si osservano le cavità

ventricolari e il setto.

2) Si aprono le cavità destre con il cardiotomo inserito nel ventricolo destro fino alla polmonare.

3) Si aprono le sezioni sinistre.

4) Ulteriori sezioni per esaminare il miocardio.

Peso: 270-310 gr. Ipertrofia: > 310-500 gr (cause: vizi valvolari, cuore polmonare cronico, ipertensione,

ipertiroidismo, ipotiroidismo). Cardiomegalia: > 500 gr (cause: vizi valvolari, cardiomiopatie, glicogenosi, acromeglia).

Ventricoli: destro 3mm, sinistro 9mm. Valvola mitrale: 10-12 cm. V. tricuspide: 13-16 cm. Aorta e Polmonare: 7-8 cm.

Miocardio sclerosi: circoscritta o diffusa (miocarditi, aterosclerosi concentrica).

Esame dei polmoni:

1) Si estraggono singolarmente e si esamina l’ilo (vasi, bronchi, linfonodi).

2) Si depongono sul tavolo, si esaminano e si sezionano lungo l’asse maggiore per l’esame interno.

Edema polmonare: presenza negli alveoli di liquido sieroso (trasudato) acellulato. Può essere: cardiaco (insufficienza,

infarto miocardico, ipertensione polmonare), tossico (ustioni, tossici), discrasico (insufficienza epatica, uremia),

neurogeno (emorragia cerebrale, shock anafilattico).

Embolia polmonare (grande, media o piccola): presenza di emboli (trombotici, adiposi, gassosi, neoplastici). Cause:

trombosi (vene profonde arti inferiori, iliache, atrio destro, periprostatiche), fratture, post-partum, malattia dei

cassoni, neoplasie. I trombi sono aderenti alle pareti, granulosi e friabili mentre i coaguli non sono aderenti alle

pareti, lucenti ed elastici.

Infarto polmonare: occlusione embolica di un ramo di piccolo o medio calibro dell’arteria polmonare. Aspetti

macroscopici: infarto “rosso” (infarcimento emorragico), può essere unico o multiplo, maggiore nelle basi, di forma

piramidale, alveoli pieni di globuli rossi, setti indenni/cancellati, necrosi (se presente) al centro del focolaio

infartuale. Aspetti clinici: asintomatico o sintomatico (dolore, tosse, dispnea, emoftoe, febbre); evoluzione: ritrovata

normalità e funzionalità, cicatrizzazione, ascessualizzazione, formazione di pseudo-cisti.

Milza 

Splenomegalia: aumento di volume della milza (>300-500 gr) mononucleosi, brucellosi, malaria, tifo, leucemia,

linfomi, anemie emolitiche, cirrosi epatica, amiloidosi, neoplasie.

TUMORI DEL POLMONE

Neoplasia: massa anomala di tessuto la cui crescita è eccessiva e scoordinata rispetto a quella del tessuto normale,

accresce in modo afinalistico e autonomo a spese dell’organo che la contiene, anche dopo la cessazione degli stimoli

che hanno evocata l’alterazione.

Fattori di rischio: fumo sigaretta (rischio 10 volte maggiore per i fumatori), inquinamento ambientale, radiazioni

ionizzanti, ereditarietà.

Sintomatologia: tosse, dispnea, febbre, emoftoe, cachessia, infezioni ricorrenti.

Classificazione topografica: tumori centrali o periferici (differiscono per la clinica).

Classificazione istopatologica: lesioni pre-neoplastiche (displasia squamosa), tumori benigni (adenomi, papillomi),

tumori maligni (primitivi: carcinoma a cellule squamose, adenocarcinoma; e secondari-metastasi: colon, fegato ecc.).

Lesioni pre-neoplastiche

Metaplasia: alterazione reversibile in cui una cellula adulta è sostituita da un’altra cellula adulta con diversa

differenziazione (es. epitelio bronchiale cilindrico ciliato si trasforma in epitelio squamoso).

Displasia (alterato sviluppo): cellule andate incontro ad alterazioni proliferative atipiche da un punto di vista

citologico riguardanti: dimensioni, forma e organizzazione cellulare. 3 gradi: lieve, moderata, grave (carcinoma in

situ). Disordine maturativo cito-architetturale che coinvolge tutto lo spessore dell’epitelio bronchiale senza superare

la lamina basale.    

Evoluzione verso il cancro: cellula alterata iperplasia displasia tumore benigno tumore maligno.

Tumori maligni

Carcinoma a cellule squamose: istotipo più frequente; insorge per lo più a livello centrale; correlato col fumo di

sigaretta. Le cellule crescono formando nidi o cordoni separati da stroma fibroso, sono presenti fenomeni di

cheratinizzazione in forma di perle cornee. Le cellule si presentano grandi con evidente nucleolo.

Adenocarcinoma: insorge per lo più a livello periferico e interessa per lo più il sesso femminile. Tende a formare

strutture ghiandolari più o meno differenziate. E’ una forma piuttosto aggressiva e ha una prognosi peggiore rispetto

al carcinoma a cellule squamose.

Carcinoma a piccole cellule: insorge per lo più a livello centrale; è formato da cellule di piccole dimensioni, rotonde,

ovali o fusate con poco citoplasma e con nucleoli assenti. L’attività mitotica è piuttosto elevata. E’ correlato al fumo

di sigaretta. Metastatizza precocemente e risponde inizialmente alla chemioterapia.

GRADING di una neoplasia: indica il grado di differenziazione citologica della neoplasia. Tre gradi: a scarso, a medio o

ad elevato grado di differenziazione. Le neoplasie meno differenziate hanno prognosi peggiore rispetto alle forme

più differenziate.

Dove metastatizza più frequentemente: sedi locoregionali (linfonodi, pleura, parete toracica) o a distanza (surrene,

encefalo, polmone controlaterale, fegato, ossa.

Fattori prognostici: stadio TMN, istotipo e grading.

Stadiazione TMN: T dimensione del tumore: T1 (<3cm), T2 (>3cm), T3 (invasione parete toracica), T4 (invasione

 

cuore, mediastino, più nodoli dello stesso lobo pomonare). N interessamento dei linfonodi: N1, N2, N3. M

metastasi a distanza: Mx, M0, M1.

Terapia: chirurgia, radioterapia, chemioterapia.

FEGATO E PANCREAS

Fegato

Ghiandola più voluminosa del corpo umano (1500g).

Patologia epatica: epatiti (acute e croniche), cirrosi, neoplasie (primitive e secondarie), lesioni pseudoneoplastiche.

Biopsia: ematossilina-eosina, collagene (reticolo, tricromica, Van Gieson, sirius red); colorazioni speciali: Perls,

Rodanina, PAS, PAS-D, Ziehl-Neelsen, Gomori, immunoistochimica.

Epatite: processo necro-infiammatorio diffuso del parenchima epatico con sintomi e alterazioni biochimiche. Può

essere acuta (durata < 6 mesi) o cronica (≥ 6 mesi).

Cause:

➢ 

Infettive virali: virus epatotropici (HAV,HBV,HCV,HDV,HEV…) e virus non epatotropici (EBV, CMV); non

virali (ameba, borrelia, brucella, leptospira rickettsie, funghi, etc).

➢ 

Non infettive alcool, farmaci, micotossine, altro.

Epatite fulminante: il fegato si presenta rimpicciolito (500gr), flaccido con capsula grinzosa, di colore giallastro

(necrosi), rossastro (spazi vascolari) o verdastro (stasi biliare). La necrosi è massiva. E’ fatale nell’80% dei casi, oppure

può evolvere in fibrosi cicatriziale o cirrosi post-necrotica. Cause: HBV, HDV, farmaci (paracetamolo ingerito a scopo

suicida), tossine dell’Amanita phalloide, fosforo, alotano, morbo di Wilson.

Epatite cronica: processo necro-infiammatorio diffuso del parenchima epatico con sintomi e alterazioni biochimiche

di durata ≥ 6 mesi. Prevalgono flogosi e fibrosi rispetto ai fenomeni degenerativo-necrotici degli epatociti. Cause:

HBV (HDV), HCV, virus non epatotropici, epatite autoimmune, epatite da farmaci, steatoepatite (alcolica o non-

alcolica), cirrosi biliare primitiva, colangite, deficit di alfa-1-antitripsina, malattia di Wilson.

Cirrosi epatica: processo diffuso caratterizzato da fibrosi e noduli epatici con sovvertimento dell’architettura epatica

e conseguente insufficienza epatica ed ipertensione portale. Cause: agenti infettivi (HCV, HBV, HDV), tossici (alcool,

farmaci), autoimmune, dismetabolica (malattia di Wilson), ostruzione biliare, criptogenetica.

Emocromatosi: malattia autosomica recessiva (Cr. 6) determinata da difetti nei meccanismi di regolazione del ferro:

provoca un accumulo di ferro negli epatociti e nei dotti biliari (>Fe; >ferritina; > saturazione transferrina). Rischio di

sviluppare epatocarcinoma.

Malattia di Wilson: malattia autosomica recessiva (Cr.13), provoca un accumulo di rame negli epatociti

(<ceruloplasmina, <rame). Rischio di sviluppare epatite cronica. α1

Epatocarcinoma: Fattori di rischio: cirrosi (emocromatosica, HCV, HBV, alcolica, – antitripsina), HBV, aflatossine,

farmaci anabolizzanti.

Adenoma epatocellulare: tumore benigno del fegato, raro (si verifica più nelle donne), asintomatico ma può causare

in pochi casi dolore e sanguinamento e può trasformarsi. Può essere causato dall’uso di contraccettivi e dal diabete.

La struttura epatica si presenta priva dei dotti biliari.

Iperplasia focale nodulare: seconda lesione benigna (dopo l’emangioma), colpisce più le donne, asintomatica, non si

trasforma. Può essere causato dall’uso di contraccettivi, da emangioma epatico, da aneurismi e neoplasie cerebrali.

La struttura epatica risulta normale.

Emangioma epatico: lesione benigna, in genere asintomatico, rottura e sanguinamento molto rari. La struttura

epatica si presenta con spazi vascolari delineati da endotelio e contenenti sangue.

Metastasi epatiche (tumori secondari): sono la neoplasia maligna più frequente a livello epatico. Possono precedere

il tumore primitivo, essere sincrone o metacrone. Sono meno frequenti nel fegato cirrotico. Le sedi primitive delle

metastasi epatiche sono: colon-retto, polmone, pancreas, colecisti e vie biliari, stomaco, mammella, altro.

Esofago

Carcinoma a cellule squamose (Fattori di rischio: tabacco, alcool, matè, radiazioni, acalasia), adenocarcinoma, tumori

neuroendocrini, tumori mesenchimali (leiomioma), linfomi, melanoma, metastasi.

Pancreas

Ha una architettura formata da lobuli separati da setti connettivali. I lobuli sono costituiti da una componente

esocrina (acini e dotti) e da una componente endocrina (isole di Langerhans). La componente esocrina costituisce

l’85% del tessuto pancreatico ed è rappresentata principalmente dalle cellule epiteliali acinari. La componente

α

endocrina è costituita da: cellule β (insulina), cellule (glucagone), cellule δ (somatostatina), cellule PP (polipeptide

pancreatico).

Neoplasie primitive:

➢ Neoplasie epiteliali (>95%)

❖ Neoplasie esocrine: duttali invasive, acinari, sierose, mucinose, intraduttali ecc.

❖ Neoplasie endocrine.

➢ Neoplasie non epiteliali.

Adenocarcinoma del pancreas: nella maggioranza dei casi è situato nella testa dell’organo; solo il 20% sono resecabili

chirurgicamente (quelli nella testa di 3-5 cm). Generalmente è solido. Prognosi: per quelli non resecabili la

sopravvivenza è di circa 5 mesi, mentre per i resecabili è di circa 15 mesi. Diffusione: infiltrazione perineurale e

linfatica, invasione vasi (asse celiaco, vena porta), invasione organi vicini (duodeno, stomaco, milza, colon), invasione

peritoneo, metastasi a distanza: fegato, polmone, surrene, cute.

Pancreatite linfoplasmocitica sclerosante (pancreatite autoimmune): massa a livello della testa del pancreas.

Sintomi: dolore, anoressia, ittero. Patologia associata: cirrosi biliare primitiva, colangite sclerosante, colite ulcerosa,

fibrosi retroperitoneale, tiroidite autoimmune, sindrome di Sjogren. Possibile risposta agli steroidi.

Lesioni cistiche del pancreas: non neoplastiche (pseudocisti, cisti mucinosa semplice, cisti da ritenzione,

endometriosi, cisti linfoepiteliale), neoplastiche (tumore solido-pseudopapillare, neoplasie sierose, neoplasie

mucinose, neoplasie intraduttali ecc.).


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in tecniche di laboratorio biomedico (FIGLINE VALDARNO, FIRENZE)
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher videlbra91@yahoo.it di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Anatomia patologica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Messerini Luca.

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