Analitica farmaceutica

Analitica farmaceutica

Spettrofotometria

La spettrofotometria UV-vis è una delle tecniche più usate per l’analitica. Permette di valutare sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo una sostanza, ma anche nelle reazioni come immunometria, in cui sostanze legate all’anticorpo o all’antigene sono leggibili allo spettrofotometro. Sono visibili anche reazioni metaboliche e reazioni tra sostanze che non assorbono, ma lo diventano. Ad esempio il DNA può essere letto e visualizzato grazie a sostanze che s’intercalano in esso, mostrandone la fluorescenza. Poi è possibile vedere l’assorbimento oppure la sua risposta come emissione di radiazione luminosa, fenomeno noto come luminescenza o fluorescenza.

Nell’assorbimento atomico le radiazioni vengono assorbite da atomi di metalli e non da molecole, utile per metalloproteine.

Radiazione

Radiazione: propagazione di energia attraverso lo spazio in forma di onde o particelle.

Radiazione elettromagnetica: sistema di onde di energia elettrica e magnetica tra loro ortogonali che si propagano insieme nello spazio alla velocità della luce.

Radiazioni elettromagnetiche non ionizzanti (NIR): radiazioni elettromagnetiche la cui energia non è sufficiente ad estrarre elettroni da un atomo o da una molecola (fenomeno della ionizzazione).

I metodi analitici spettroscopici si basano sullo scambio di energia, quindi sulle interazioni tra la radiazione elettromagnetica e la materia. Questo tipo di interazioni sono evidenti ad occhio nudo nel caso di radiazioni che cadono nel campo visibile.

Le radiazioni elettromagnetiche sono onde caratterizzate da una lunghezza d’onda (λ), da un’ampiezza e da una frequenza (ν). La λ va da un picco all’altro ed è inversamente proporzionale alla ν, che corrisponde al numero di oscillazione nell’unità di tempo.

Le radiazioni si possono considerare come un fascio di particelle chiamati quanti (o fotoni), che rappresentano l’unità particolata delle radiazioni. Il quanto è la quantità di energia contenuta in un singolo fotone. L’energia E è direttamente proporzionale alla ν e inversamente proporzionale alla λ, quindi più aumenta l’ampiezza di λ, minore sarà l’energia della radiazione.

La radiazione elettromagnetica viene considerata come una forma di energia radiante dotata di una doppia natura, ondulatoria e corpuscolare. In ogni momento il vettore campo elettrico E_T e il vettore campo magnetico H sono fra loro perpendicolari e anche alla direzione di propagazione X.

Campo elettrico:

• Prodotto da cariche elettriche.
• L’intensità si misura in V/m.
• L’intensità è massima vicino alla sorgente e diminuisce con la distanza.
• Può essere schermato da alcuni materiali comuni.

Campo magnetico:

• Sono prodotti dalle cariche elettriche in movimento.
• L’intensità si misura in Ampere al metro (A/m) o in Tesla (T).
• L’intensità è massima vicino alla sorgente e diminuisce con la distanza.
• Non viene schermato dalla maggior parte dei materiali di uso comune.

Spettro elettromagnetico

Lo spettro del visibile va da 380 nm ai 780 nm, l’ultra violetto ha radiazioni con λ più basse, ma E più alte, mentre l’infrarosso ha λ più alte e E più bassa. Raggi X e raggi gamma hanno un’energia talmente elevata da estrarre elettroni e ionizzare le molecole.

Radiazioni ottiche: radiazioni comprese tra l’ultravioletto e l’infrarosso, quindi hanno λ tra 100 e 1 nm. Sono classificate in:

• Coerenti: come i laser, radiazioni artificiali emettenti un fascio di luce monocromatica direzionata su una specifica lunghezza d’onda.
• Non coerenti: tutte le radiazioni ottiche diverse dal laser.

Lo spettro delle radiazioni ottiche si suddivide in:

• R. ultraviolette: 100 < λ < 400, divise in:
  • UVA: 315 - 400 nm
  • UVB: 280 - 315 nm
  • UVC: 100 - 280 nm
• R. visibili: 380 < λ < 780
• R. infrarosse: 780 nm < λ < 1 mm, divise in:
  • IRA: 780 - 1400 nm
  • IRB: 1400 - 3000 nm
  • IRC: 3000 nm - 1 mm

Effetti biologici delle radiazioni ultraviolette

Cute: lesioni di tipo eritematoso a carico delle parti scoperte. Un’amplificazione della risposta cutanea è causata da agenti fotosensibilizzanti presenti in essenze vegetali e da agenti fotoallergizzanti (tetracicline, sulfamidici, FANS, antidepressivi, diuretici, cosmetici, distillati del catrame, coloranti, etc.). Gli effetti cronici sono causati da aumento delle fibre elastiche con diminuzione del collagene e atrofia dell’epidermide, cui si associano metaplasia cellulare con possibili esiti in neoplasia.

Occhio: gli effetti oculari possono essere transitori (si sviluppano entro 6-12 ore con congiuntivite e cheratite e scompaiono entro 24-48 ore) e permanenti. Per λ comprese tra 295 e 325 nm (UV-B) vi è il rischio di insorgenza della cataratta.

Quindi va ricordato che la luce è il fondamento della vita, ma a volte a causa delle sue interazioni con la materia può dare effetti indesiderati.

I metodi spettroscopici si basano sulle proprietà della luce, la struttura elettronica delle molecole e l’interazione dei fotoni con le molecole.

Proprietà della luce: il fotone

La luce è una forma di energia rappresentata da un campo magnetico ed un campo elettrico. La base teorica dell’interazione tra radiazione e materia è la natura quantica del trasferimento di energia. Il carattere ondulatorio della radiazione può essere descritto da:

• Lunghezza d’onda (λ): distanza tra le due creste dell’onda
• Frequenza (ν): numero di oscillazioni complete che l’onda fa per ogni unità di secondo espressa in numero di oscillazioni/secondo o in Hertz (Hz)
• Velocità della luce nel vuoto: c = 2.998 x 10⁸ m/s

E = hν = hc/λ con h = 6,626 x 10^-34 Js.

Tutte le onde elettromagnetiche, indipendentemente dalla loro λ, E e ν, si propagano nel vuoto con la stessa velocità, la velocità della luce. c ≈ 3 x 10⁸ m/s. La velocità può variare al variare del mezzo.

Sia le radiazioni ultraviolette che quelle del visibile, quando reagiscono con la materia, riescono ad interagire con gli elettroni più esterni degli atomi e ne provocano delle transizioni energetiche a livelli energetici più alti normalmente non occupati allo stato fondamentale. Gli infrarossi, avendo energia più bassa, riescono a provocare solo oscillazioni utili per capire la struttura della molecola e i gruppi funzionali che la compongono.

Ogni orbitale ha una propria energia e l’elettrone che lo occupa ha quella energia, ma se vuole passare ad uno stato più alto è necessaria un’energia corrispondente alla differenza di energia tra i due salti. Quindi una radiazione verrà assorbita quando ha energia esattamente corrispondente a quella necessaria al salto per passare da un orbitale all’altro.

Un atomo ha orbitali con energie ben definite per cui le radiazioni che vengono assorbite sono ben definite da spettri discreti a righe, poiché gli atomi non hanno sottolivelli rotazionali di cui sono dotate invece le molecole.

Spettro: rappresenta un atomo colpito da un insieme di radiazioni e tra tutte ha assorbito quelle corrispondenti alle righe scure, poiché non sono più visibili.

Nel caso delle molecole, in cui gli atomi sono legati attraverso gli orbitali molecolari, gli elettroni di legame possono anche vibrare e ruotare, quindi le molecole si muovono e di conseguenza hanno una posizione e una corrispondente energia, in modo che gli orbitali molecolari assumano diversi livelli energetici. Per questo nelle molecole si hanno più livelli vibrazionali con sottolivelli rotazionali: ci sono stati elettronici fondamentali con energia pari a zero, ma per arrivare al primo stato elettronico eccitato, ci sono una serie di livelli intermedi in cui gli elettroni possono posizionarsi. Quindi una molecola colpita da un fascio di radiazioni, non assorbirà solo quanti definiti, ma ha talmente tanti stadi diversi da avere spettri a bande o continui, non a righe.

Quindi l’energia totale di una molecola è data dalla somma di energia elettronica (UV-vis), energia vibrazionale (IR) e energia rotazionale (microonde).

Nella stessa unità di spazio, la frequenza sarà maggiore quanto minore è l’ampiezza. Quindi lo spettro di assorbimento è il complesso di radiazioni monocromatiche che un composto è in grado di assorbire. Ogni sostanza o molecola ha un suo spettro di assorbimento in base ai gruppi cromofori presenti. Si rappresenta graficamente riportando la quantità di luce assorbita (A) in funzione di λ.

Cromofori

Sono i gruppi che hanno assorbimento caratteristico, una molecola può averne uno o più. Se una molecola ha più cromofori, assorbirà in base ai principali e alle interazioni tra i vari cromofori, in modo da determinarne lo spettro di assorbimento. Ci sono cromofori visibili direttamente mediante spettrofotometri e altri no, come il metanolo.

Le transizioni tra i differenti livelli energetici degli elettroni esterni negli atomi e nelle molecole hanno energie simili a quelle dei legami chimici, dell’ordine delle centinaia di kJ/mol. Queste energie corrispondono a frequenze e lunghezze d’onda nelle regioni spettrali della luce visibile e dell’ultravioletto vicino e lontano.

Coenzimi pirimidinici

Tra i cromofori più utili si trovano quelli dei coenzimi pirimidinici come NAD⁺ e NADH. Tra le due forme cambia la struttura dell’anello, perché zucchero e adenina restano invariate. La nicotinammide ridotta perde la sua aromaticità, prendendo due elettroni dal doppio legame e assorbe la radiazione luminosa a 340 nm, ma l’adenina assorbe a 260 nm. Quindi leggendo la sostanza ad entrambi gli stati di ossidazione a 260 nm non avrebbe differenza, mentre a 340 nm il NAD⁺ non ha assorbimento, mentre il NADH ha un picco di assorbimento. Questa variazione di assorbimento viene sfruttata in dosaggi enzimatici usati in analisi biochimico-cliniche.

Bilancio di GTP

La GPT è l’alanina aminotransferasi, una transaminasi che in base alla sua quantità marca la funzionalità del fegato, quindi un aumento di essa indica patologie epatiche. Per dosare la GPT si può sfruttare il fatto che il NAD⁺ abbia assorbimento diverso dal NADH. Quindi si prende il sangue del paziente e si aggiunge alanina e α-chetoglutarato, che vengono trasformati dal GPT in glutammato e piruvato. Si aggiunge anche lattato deidrogenasi, che attraverso il NADH trasforma il piruvato in lattato e NAD⁺. Se nel siero c’è molta GPT si avrà molto piruvato e aggiunti i reattivi si avrà la trasformazione, quindi se l’assorbimento a 340 nm diminuisce, tanto maggiore è la quantità di NAD⁺ e quindi di GPT. Si fa quindi una retta di taratura per quantificare la reazione.

Bilancio di lattato deidrogenasi

La reazione viene usata anche se si vuole dosare la lattato deidrogenasi che cresce in presenza di problemi al fegato ed è indicativa di avvelenamenti: si prende il siero, si aggiunge piruvato e NADH e si guarda come varia l’assorbimento del nicotinammide. Se c’è minor assorbimento a 340 nm, vuol dire che molto NADH è stato trasformato in NAD⁺.

Bilancio del glucosio

Il glucosio nel campione in presenza di ATP ed esochinasi reagirà per dare glucosio-6P e ADP. Il primo poi reagirà con la glucosio-6P deidrogenasi e si aggiunge il NAD⁺, così si forma un prodotto ossidato, il fosfogluconolattone, mentre si riduce il NAD⁺ a NADH, causando la comparsa del picco di assorbimento a 340 nm in maniera proporzionale alla quantità di glucosio presente nel campione.

Legge dell’assorbimento nell’UV-Vis

Il campione viene prima sciolto in un solvente sciolto, organico o acquoso, e posto in una cuvetta. Da una lampada viene emesso un fascio di radiazioni pure I₀ che colpiscono la cuvetta, con diversi destini per la luce:

• Riflessa: la luce raggiunge un materiale diverso rispetto al vuoto, lo colpisce e viene deviata in un’altra direzione. È un fenomeno che viene attenuato il più possibile con i materiali della cuvetta.
• Diffusa: la radiazione colpisce le particelle in sospensione, sia della sostanza stessa non sciolta che particelle inquinanti, e viene deviata in varie direzioni. Fenomeno molto ridotto, ma certe tecniche lo sfruttano per quantificare delle sostanze, specialmente proteine di tipo colloidale o reazioni tra antigene ed anticorpo.
• Assorbita: dalle molecole del campione perché la radiazione ha la λ sufficiente per il salto elettronico degli elettroni del cromoforo presente.
• Trasmessa: arriva direttamente al rilevatore, nota come I_t o I₀.

Legge di Lambert

Quando una sostanza è disciolta in una soluzione e la luce la attraversa, l’intensità della luce trasmessa decresce in progressione geometrica all’aumentare dello spessore in progressione aritmetica. Quindi tanto maggiore è lo spessore b, o cammino ottico, tanto l’intensità della luce I viene diminuita. Se si ha una soluzione molto diluita, che non si può concentrare, conviene utilizzare una cuvetta da 3-4 cm per vedere meglio l’assorbimento.

Legge di Beer

La radiazione incidente che passa attraverso la soluzione esce con un’intensità che decresce in modo analogo man mano che aumenta la concentrazione della sostanza assorbente. Combinando le due equazioni, si ottiene la legge di Lambert-Beer: log(I₀/I_t) = a·b·c.

Il logaritmo decimale del rapporto tra la luce incidente e quella trasmessa è detta assorbanza (un tempo «densità ottica» o «estinzione») ed è adimensionale. A = log(I₀/I_t).

La trasmittanza è il rapporto tra l’intensità della radiazione trasmessa e quella incidente I_t/I₀ e può assumere valori tra 0 e 1. Esprime quale frazione della luce incidente ha attraversato il campione senza essere assorbita e solitamente si esprime in percentuale: A = log(1/T).

Non viene impiegata perché non esiste relazione lineare tra concentrazione e trasmittanza come esiste tra A e C. La costante b è sempre espressa in cm.

Se la concentrazione c è espressa in g/L, la costante di proporzionalità a è l’assorbività ed è espressa in L/g·cm. Se la concentrazione è c espressa in moli/L, il coefficiente di proporzionalità è l’assorbività molare ε (o coefficiente di estinzione molare) ed è espressa in L/moli·cm. La costante ε esprime la probabilità che una sostanza assorba una data radiazione, perché contiene elettroni che saltano ad uno stato eccitato.

Valori della ε:

• > 10000 = assorbimenti ad alta intensità;
• 6 < 1000 = assorbimenti di bassa intensità;
• 100-1000 = transizioni proibite.

La ε è l’assorbanza di una sostanza alla concentrazione 1 M ad una data lunghezza d’onda, sciolta in un determinato solvente e in una cella da 1 cm. Per leggere l’A allo spettrofotometro di certe soluzioni è necessario diluirle.

Un’altra costante è il coefficiente di estinzione specifico, si trova anche nelle farmacopee per ogni farmaco. A_1cm1% corrisponde all’assorbanza con b = 1 cm e c = 1g/100ml di solvente. Si utilizza quando il PM è incognito o variabile.

In conclusione, la legge di Lambert-Beer permette di calcolare la concentrazione di un campione incognito dal suo assorbimento. A = ε · C · l; quindi C = A/ε in una cella da 1 cm, in un determinato solvente e ad una data λ. Quando una sostanza è sciolta in un dato solvente, questo instaura delle interazioni con essa cambiando gli stati elettronici sia fondamentali che eccitati di una molecola. Quindi anche i salti elettronici che possono avvenire cambiano e le differenze di energia possono aumentare e diminuire, riflettendosi sulla lunghezza d’onda della radiazione assorbita. Perciò va sempre specificato “in un determinato solvente.”

Analisi: scelta della λ

Avendo una soluzione incognita di cui non si conoscono le caratteristiche spettroscopiche, si fa il suo spettro di assorbimento: A in ordinata e le varie lunghezze d’onda in ascissa (nm). È utile per caratterizzare la sostanza e aiuta a scegliere la lunghezza d’onda per l’analisi, solitamente i picchi di assorbimento. Solitamente si sceglie la λ massima d’assorbimento, possibilmente lontana dai massimi di assorbimento del solvente, poiché ci sono solventi che assorbono, e si evita la zona tra i 200-220 nm. Avere un numero più grande da leggere comporta un errore inferiore, invece se è più piccolo l’errore potrebbe essere maggiore nella lettura. In quel punto si ha anche la massima sensibilità di lettura. Inoltre solitamente ad un massimo esiste un punto di plateau, ovvero un range di λ in cui il valore di A, e anche di ε, è costante, quindi si ha maggior aderenza alla legge di Lambert-Beer (diretta proporzionalità tra A e C).

Sempre considerare che la luce incidente in uno spettrofotometro, un monocromatore seleziona le λ inviate alla sostanza e ci sono sempre delle bande spettrali, un piccolo range di λ monocromatiche ma fino ad un certo punto. Quindi scegliendo 280 nm, nella successiva è possibile inviare una radiazione di 281, 279 nm e che quindi il fascio non sia così perfettamente monocromatico. Se ci si pone in un punto di plateau, la sostanza assorbe sempre allo stesso modo e la ε è sempre identica. In un punto non di plateau, piccolissime variazioni di λ si riflettono sul risultato.