Analitica farmaceutica

La fluorescenza

La fluorescenza è l'emissione di radiazioni da parte di una sostanza quando questa ha assorbito a sua volta una radiazione luminosa. La fluorescenza è un fenomeno che fa parte della luminescenza, che è l'emissione di radiazioni, come avviene anche in: - Chemiluminescenza: emissione di fluorescenza in seguito ad una reazione chimica, come accade con illuminol che diventa fluorescente grazie alla reazione con l'eme, che ne catalizza l'ossidazione. - Bioluminescenza: reazione biologica che permette la luce delle lucciole. La sostanza assorbe delle radiazioni e passa ad uno stato eccitato, in base alle radiazioni può passare a più livelli dello stato eccitato in cui possono avvenire vari fenomeni. - Conversione interna: quando la molecola passa da uno dei livelli/sottolivelli dello stato eccitato ad un livello ad uguale energia di un altro stato in cui può trovarsi la molecola, senza perdita di energia. Spin mantenuto (es.S1→S0).• Interystem crossing: transizione proibita che comunque avviene, lo spin può invertirsi per arrivare ad uno stato eccitato di tripletto, che solitamente ha minore energia. Stato particolare eccitato della molecola in cui questa ha più tempo di reagire con le molecole circostanti, specialmente l'ossigeno, per dar luogo all'ossigeno singoletto, che va ad attaccare i substrati biologici ossidando (es. T1→S0).• Fluorescenza: emissione di radiazione che avviene dal livello più basso del primo stato eccitato, l'S1. Emissione a tante lunghezze d'onda vicine in base a quanti livelli rotazionali-vibrazionali ci sono nella molecola.• Fosforescenza: emissione di radiazione tra stati che possiedono spin diverso (es. T1→S0). Comporta conversione a tripletto. Dura di più della fluorescenza. 931/10Esistono bande (molecole) o righe (atomi) di assorbimento, ma anche bande o righe di emissione.Conversione interna: dallo stato vibrazionale

più basso di uno stato di S eccitato a maggiore energia E * a uno stato Vibrazionale1 superiore di uno stato di singoletto eccitato di minore energia E *.

Rilassamento vibro-rotazionale: in uno stesso stato eccitato da sottolivelli vibrazionali più alti a sottolivelli vibrazionali più bassi.

Assorbimento di radiazioni luminose: quando la molecola ha assorbito la radiazione incidente, i suoi elettroni passano ad uno stato energetico superiore. Dallo stato eccitato, per passare ad uno stato di energetico inferiore, la molecola può andare incontro a due tipi di processi:

1. La maggior parte delle molecole trasferisce l'eccesso di energia all'intorno con un processo non radiativo: l'energia emessa, sotto forma di calore, permette alle molecole circostanti di compiere vibrazioni, rotazioni e traslazioni.
2. Una piccola parte delle molecole subisce un decadimento radiativo: l'energia in eccesso viene liberata come fotoni, dando luogo ai due.

fenomeni di fluorescenza o fosforescenza. Poiché la fluorescenza trae origine dalla caduta dell'elettrone dal più basso livello vibrazionale del primo stato elettronico eccitato a uno dei livelli vibrazionali dello stato fondamentale, lo spettro di fluorescenza è in generale simile allo spettro di assorbimento, ma spostato a lunghezze d'onda maggiori. Anche gli spettri di fosforescenza sono spostati verso il rosso rispetto agli spettri di assorbimento, ma di più di quanto osservato per la fluorescenza; infatti l'energia dello stato di tripletto T1 è in genere più bassa di quella dello stato di singoletto S1. Nel fluorimetro, si fa lo spettro di assorbimento che corrisponde allo spettro di eccitazione, quindi le radiazioni assorbite sono le stesse che eccitano la molecola. Si sceglie la radiazione più assorbita, quindi la λ max di assorbimento che è anche la λ max di eccitazione. Dopo che viene inviata,

la molecola ritorna allo stato fondamentale emettendo radiazioni sotto forma di fluorescenza che formano lo spettro. Basta una radiazione per avere uno spettro e qualunque radiazione inviata porta lo stesso spettro di emissione.

Legge di Stokes: l'energia del fotone emesso appartiene ad una regione dello spettro spostata verso λ maggiore rispetto alla λ del fotone. La banda di luminescenza è indipendente dalla radiazione monocromatica eccitatrice perché appartenente a una medesima banda di assorbimento (l'intera banda di emissione è presente per ogni radiazione monocromatica assorbita appartenente alla banda illuminante). La banda di assorbimento è ottenuta come inviluppo delle righe di eccitazione.

Resa quantica di fluorescenza: rappresenta la probabilità che ci sia fluorescenza ad una data λ, nota come f o ϕ. Tutte le molecole che assorbono nel visibile/UV sono quindi potenzialmente fluorescenti, ma il fenomeno.

è inrealtà rilevante solo per alcune di esse, a causa dell’esistenza di fenomeni dissipativi non radiativi che competonocon l’emissione di radiazione. Questi fenomeni comprendono:

• Conversione interna: perdita di energia in maniera non radiativa, soprattutto a causa di urti con lemolecole di solvente o con le pareti del contenitore, che sono pure ala base del fenomeno di rilassamentovibrazionale, cioè del decadimento da un livello vibrazionale all’altro, che spiega perché le frequenze diemissione sono più basse di quelle di assorbimento.
• Intersystem crossing: transizione tra uno stato di singoletto e uno di tripletto le cui curve di potenziale diincontrano in un punto, a cui generalmente fa seguito perdita di energia sotto forma di calore ofosforescenza (ritardata nel tempo).
• Quenching: dovuto alle collisioni con molecole di soluto capaci di interagire con lo stato elettronicoeccitato, come O e I .

-210f = K /K + K + K +

Kfluorescenza fluor fluor conversione i. intersystem c. quenching

Le k rappresentano le costanti cinetiche dei fenomeni descritti, ma può anche essere scritta come f = numero di fotoni emessi/numero di fotoni assorbiti.

fluorescenza: è un numero compreso tra 0 e 1, la fluoresceina ha f=1.

La resa quantica influisce sul metodo che è più sensibile se essa è elevata, quindi l'intensità della radiazione emessa ad una certa λ è proporzionale a f.

Alla fluorescenza si abbinano dei fenomeni di diffusione e due sono i più noti:

• Diffusione di Rayleight: Si verifica quando la radiazione attraversa un mezzo trasparente in cui incontra particelle con diametro molto inferiore della propria lunghezza d'onda, circa 1/10, e si ha diffusione da parte di queste. La luce che diffonde ha la stessa lunghezza d'onda di quella incidente e un'intensità proporzionale alla quarta potenza della frequenza della luce incidente.

In un fascio policromatico le radiazioni a bassa λ sono quelle che vengono diffuse più efficacemente.

Diffusione di Tyndall: Si verifica in presenza di sistemi colloidali nei quali le particelle hanno un diametro confrontabile con la λ dellaluce visibile, quindi si ha diffusione da parte di quelle piccole particelle. L’intensità della luce diffusa è proporzionale alla seconda potenza della frequenza della radiazione incidente.

Diffusione di Raman: Fenomeno che dipende dal solvente, si verifica quando viene diffusa solo una piccolissima frazione della luce che incide su un mezzo trasparente. Si può vedere allo spettrofotometro, ma non è sempre presente. In questo caso la λ della radiazione può essere spostata verso valori minori o maggiori. Se si usa MeOH è spostata a λ maggiori di +30nm, con CHCl di +10 nm.

L’effetto Raman risulta dall’interazione dei movimenti vibrazionali e/o

rotazionali delle molecole con una radiazione elettromagnetica. Durante la diffusione, una parte della energia della radiazione incidente può essere sottratta e convertita in energia vibrazionale e rotazionale. La parte della luce diffusa cui è stata sottratta questa quota di energia è di λ maggiore della I .0 La risultante radiazione, che non è la fluorescenza della sostanza, avrà energia inferiore e λ maggiore della radiazione incidente. Si ha così una radiazione di emissione debole che può interferire o essere confusa con la fluorescenza del campione. Poiché la quantità di energia sottratta è sempre costante, le bande Raman appaiono separate dalla radiazione incidente con la stessa differenza di frequenza, indipendentemente dalla λ di eccitazione. Se la banda Raman interferisce conviene porsi ad una di eccitazione inferiore rispetto alla fluorescenza del campione così la banda Raman del solvente,

che esce a ≈20-40 nm dalla λ di eccitazione, uscirà anch’essa a λinferiori, separandola dalla banda di fluorescenza del campione che invece resta costante. La partenza di emissioni di fluorescenza si ha dal più basso livello vibrazionale dello stato eccitato di singoletto edè indipendente dalla λ di eccitazione, quindi gli spettri sono sempre uguali. La banda Raman invece cambia e si sposta con la λ di eccitazione, sempre di 20-30 nm. - Variabili che influiscono sulla emissione di fluorescenza - · Effetto della struttura molecolare Il fenomeno della fluorescenza è favorito dalla presenza di gruppi aromatici con bassi livelli di energia necessari per le transizioni π→π*. La resa quantica aumenta con il numero degli anelli ed il grado di condensazione. Casi in cui la transizione che richiede minor energia è del tipo n→π*, l’elettrone passa rapidamente allo stato di tripletto impedendo la

fluorescenza.Casi in cui la transizione più facile è del tipo π→π* e questi prodotti emettono fluorescenza.Anche i sostituenti sono rilevanti: la presenza di un gruppo carbossilico o carbonilico riduce la fluorescenza,perché la transizione n→π* ha un’energia minore della π→π* e la resa quantica diminuisce.Ricordiamo che le molecole che contengono atomi pesanti come Cl, Br e I danno il fenomeno della fluorescenzameno accentuato a causa delle frequenti conversioni intersistema. Anche la presenza in soluzione di molecoleparamagnetiche, come O , determina una diminuzione del fenomeno, dato che prendono la fluorescenza.2Invece la presenza di gruppi carbonilici o doppi legami a elevata coniugazione in composti alifatici e aliciclicifavoriscono la fluorescenza. 11Il Trp è una sostanza fluorescente a causa dei suoi due anelli pirrolici ed è per questo che molte proteine sonofluorescenti. Assorbe tra a 260-290 nm ed emette

a 320-420 nm.· Effetto della rigidità strutturaleMolti composti organici fluorescenti sono caratterizzati da