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Trasferimento di massa in fase stazionaria
Sf2D e D riducono la frequenza media alla quale le molecole di analita dalla fase stazionaria raggiungono l'interfaccia con la fase mobile, dove potrà avvenire il trasferimento verso la fase eluente. In film spessi, dunque, le molecole dovranno viaggiare di più per raggiungere la superficie, e se hanno anche coefficienti di diffusione piccoli si sposteranno ancora più lentamente. La minore velocità di trasferimento causerà un incremento dell'altezza del piatto.
Il trasferimento di massa in fase stazionaria, dunque: dipende dal diametro e dalla forma delle particelle di fase stazionaria; dipende dalla velocità di migrazione (desorbimento o partizione) del soluto dalla fase stazionaria verso la fase mobile; è direttamente proporzionale al quadrato dello spessore del film sulle particelle di supporto; è inversamente proporzionale al D del soluto nella fase stazionaria; è direttamente proporzionale alla velocità.
lineare del flusso della fase mobile. C'è il contributo relativo alla fase mobile e viene a sua volta espresso dalla relazione: HC = w • d ū / Dp2 • M x M Dove: - w è una costante che dipende dall'impaccamento e dal diametro della colonna - d è il diametro medio delle particelle della fase solida - D è il coefficiente di difusione nella fase mobile Il trasferimento di massa in fase mobile, dunque: - dipende dal diametro della colonna - è direttamente proporzionale al quadrato del diametro delle particelle - è direttamente proporzionale alla velocità del flusso - è inversamente proporzionale al D del soluto nella fase mobile L'Efficienza di una colonna può dipendere da Fattori relativi alla colonna o da Fattori extra-colonna (max 10%). In un cromatografo, oltre alla colonna, infatti, sono presenti tubi di connessione, giunzioni della linea di flusso della fase mobile che generano fenomeni di turbolenza o didiffondere e separare in modo efficace i componenti di un campione. Per ottenere una formattazione corretta del testo, è possibile utilizzare i seguenti tag HTML: - `` per indicare il testo in apice, ad esempio "²" - `` per indicare il testo in pedice, ad esempio "H₂O" - `` per evidenziare il testo in grassetto - `` per evidenziare il testo in corsivo - `` per inserire un'interruzione di linea Ecco come potrebbe apparire il testo formattato: diffusione longitudinale. L'effetto finale è un allargamento del picco cromatografico, che risulta proporzionale al volume dei circuiti entro i quali passa la fase mobile, e quindi anche alla lunghezza dei tubi di connessione e ad eventuali volumi morti. All'allargamento della banda concorrono in definitiva numerosi fattori che possono essere così riassunti: WT = Wj + Wf + We + Wd + Wc Dove: WT = larghezza totale del picco; Wj = allargamento dovuto ai volumi morti e alla dispersione del soluto nell'iniettore; Wf = allargamento dovuto alle connessioni dopo l'iniettore e prima del detector; We = allargamento dovuto ai capillari di connessione iniettore/colonna e colonna/detector; Wd = allargamento dovuto al detector; Wc = allargamento dovuto alla colonna. Domanda: Efficienza Risoluzione: è un parametro che indica il grado di separazione tra due picchi (che dovrebbero avere profili stretti), ovvero la capacità di un sistema cromatografico di diffondere e separare in modo efficace i componenti di un campione.
Separare analiti diversi. In termini matematici, la Risoluzione tra due picchi adiacenti (R) è espressa dal rapporto fra le loro distanze (tempi di ritenzione) e la semisomma delle rispettive larghezze alla base:
A volte, può accadere che i due picchi siano ASIMMETRICI (avere una forma gaussiana non simmetrica); ciò accade, nella maggior parte dei casi, a causa di un eccesso di quantità di soluto rispetto alla quantità di fase stazionaria (sovraccarico della fase stazionaria).
L'eccesso di soluto altera il coefficiente di distribuzione K = C / C, il quale - idealmente - dovrebbe essere costante e indipendente dalla concentrazione di soluto (se così fosse, avremmo bande simmetriche di forma gaussiana). Nelle colonne reali, tuttavia, K cambia all'aumentare della concentrazione di soluto.
La saturazione di tutti i siti attivi della fase stazionaria produce due possibili conseguenze:
Tailing: quando la maggior parte dell'analita
si lega più stabilmente alla fase stazionaria, producendo un'eluizione "ritardata" dell'analita sulla coda del picco (tail); si genera un tracciato che sale bruscamente per scendere lentamente.
Il tailing è molto comune rispetto al fronting, e può avere diverse cause: sovraccarico del campione; interazione dell'analita con residui silanolici liberi (tailing termodinamico); risposta del detector lenta; effetti extra-colonna; cinetiche di adsorbimento/desorbimento lente.
Fronting: quando buona parte del soluto, per effetto cooperativo, si lega e si slega più rapidamente alla fase stazionaria, producendo un'eluizione "anticipata" di soluto sul fronte del picco (front); si genera un tracciato che sale lentamente per scendere rapidamente.
Per evitare l'asimmetria dei picchi, che peggiora ovviamente la risoluzione di una colonna, si può operare in due modi: ridurre la quantità di campione introdotta
(piccoli volumi di soluzionidiluite); aumentare la superficie dei siti attivi della fase stazionaria (es. riduzione dellagranulometria).
Il fattore di simmetria (A ), ovvero l’entità dell’asimmetria, viene espresso dal rapporto diSasimmetria:
Dove A e B sono le distanze della curva dalla verticale tracciata nel punto di massimodel picco, misurate in corrispondenza del 10% dell’altezza del picco, rispettivamente a sinistrae destra del punto massimo.
Nel caso di tailing A > 1; nel caso di fronting A < 1.
Il valore minimo di R dovrebbe essere 1 (sovrapposizione dei picchi del 4%); per R = 1.5S S(sovrapposizione dello 0.3%) la separazione è considerata completa; per R > 1.5 i picchisono completamente risolti.
Come si calcola la Risoluzione? La Risoluzione è funzione di altri 3 parametri: Efficienzak’della colonna (N); fattore di Selettività (α); fattore di ritenzione ( ), ovvero il temponecessario per gli analiti per eluire
dalla colonna:Dato che un importante obbiettivo della cromatografia è quello di ottenere una Risoluzione ottimale nel minor tempo possibile, si può intervenire su tutti questi parametri per migliorarla:
Interventi su Selettività: per modificare il fattore di Selettività si può agire in 5 modi:
• Cambiare i solventi della fase mobile, e dunque la sua forza eluente (e'): uno dei parametri con cui viene espressa la forza della fase mobile è la "forza eluente" (e'), la quale esprime l'abilità della fase mobile a spiazzare il soluto dalla fase stazionaria. Maggiore è la polarità del solvente, tanto più alta sarà la sua forza eluente. Un approccio utile è quello di scegliere, per la fase mobile, due solventi (miscela binaria A + B) miscibili tra loro, di cui uno forte e l'altro debole in termini di forza eluente. In fase diretta (cioè nella cromatografia di adsorbimento), normalmente,
Il solvente base A (fase mobile) è l'esano o l'acetato di etile, mentre in fase inversa (cioè nella cromatografia di ripartizione) è l'H2O o tamponi ad opportuno pH, mentre il solvente B (la fase stazionaria) è il MeOH, l'ACN o il THF. Quando si decide di cambiare il solvente B, ha senso scegliere un solvente con caratteristiche di selettività differenti rispetto a quello scelto inizialmente, ovvero scegliendone uno appartenente ad un altro gruppo.
In fase inversa, un approccio classico è invece quello di aumentare/diminuire la forza eluente mediante aggiunta/diminuzione della % di H2O/tampone, oppure di cambiare totalmente la composizione dell'eluente secondo il triangolo di Snyder, secondo cui le caratteristiche che contribuiscono alla selettività di un solvente sono legate a diversi parametri quali: presenza di gruppi donatori di protoni (X+); presenza di gruppi accettori di protoni (X-); interazioni dipolari.
(X ).c nSi scelgono i solventi che hanno le caratteristiche più opportune per trovare la miscela di solventi ottimale, e aggiustando opportunamente il rapporto dei loro volumi, si può ottenere una fase mobile con una forza eluente adatta a avere valori ottimali del k' degli analiti (cioè, spesso, determina la loro separazione). Modificare la composizione qualitativa della fase mobile- Variare il pH della fase mobile: il pH può influenzare la dissociazione di analiti acidi/basici influenzando la loro idrofobicità/idrofilia, e quindi i t .R
- Modificare la fase stazionaria: è uno dei mezzi più potenti per modificare la selettività, e può influenzare anche k' ed N.
- Modificare la temperatura: questa modifica non è molto influente nella LC, ma è rilevantissima nella GC (gascromatografia); in generale, un aumento di temperatura produce un incremento della forza eluente della fase mobile, una diminuzione dei
diR 0 Mun analita non trattenuto dalla fase stazionaria, e che pertanto fluisce alla stessa velocità della fase mobile. Il valore di k' è un parametro su cui si può intervenire per migliorare la separazione di due picchi sovrapposti (Risoluzione), sebbene abbia senso incrementarlo solo se il t Rdell'analita è basso (in alternativa, conviene agire sugli altri fattori della Risoluzione, come N oppure α). Ai fini del miglioramento della Risoluzione, i valori di k' devono essere compresi nel range 3-4, e NON devono essere < 1-2 (troppo vicini al t ). Per k' > 4 la risoluzione non migliora praticamente più. funzione della composizione della fase mobile. Nella LC il valore del fattore k' è Per ottimizzare il fattore di capacità
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