Analisi Qualitativa dei Farmaci II

ANALISI

QUALITATIVA

DEI FARMACI II

INTRODUZIONE

L’analisi qualitativa è la disciplina che si occupa di determinare che “cosa” è presente all’interno di

un campione, a differenza dell’analisi quantitativa che determina la “concentrazione” delle

componenti note in un campione.

L’analita è la sostanza da analizzare all’interno di un campione, con esami di tipo sia analitico che

quantitativo.

L’analisi qualitativa consta di una serie di saggi preliminari, analisi mirate e tecniche generali.

Il campione può essere classificato secondo la percentuale di impurezze presenti:

• Campione puro: la componente principale è presente in concentrazione maggiore del 98%

p/p;

• Campione impuro: la componente principale è presente in concentrazione compresa tra il

90-97% p/p;

• Campione costituito da miscela vera e propria: nessuna componente presente in

concentrazione superiore al 90% p/p.

L’analisi qualitativa deve seguire delle fasi distinte:

1. Isolamento delle componenti;

2. Purificazione delle componenti;

3. Determinazione del comportamento al calore

a. Saggio al coccio;

b. Saggio al tubicino;

4. Determinazione delle costanti fisiche: generalmente si opera la misura della temperatura di

fusione per i solidi e quella di ebollizione per i liquidi. In quest’ultimo caso si può procedere

alla cristallizzazione del liquido e relativa ricerca del punto di fusione da confrontare con la

letteratura;

5. Esame organolettico

a. Odore;

b. Colore;

c. Sapore;

6. Analisi elementare: esame condotto per ricercare specifici elementi presenti nella struttura

del composto come S, N, Cl, Br, I, F, P, As;

7. Caratteristiche di solubilità: test condotto con diversi tipi di solvente e che permette, a

seconda del tipo di risposta ottenuta, di condurre la successiva ricerca dei gruppi

funzionali;

8. Saggi di riconoscimento a carattere generale: ricerca di insaturazioni o nuclei aromatici;

9. Saggi di riconoscimento per gruppi funzionali specifici: possibili falsi positivi e falsi negativi,

per cui si rende necessaria l’elaborazione con spirito critico dei dati ottenuti;

10. Analisi critica dei dati ottenuti: permette di avere già un’idea generale della molecola in

esame, sebbene siano comunque necessari più step per avere un’identificazione più

precisa;

11. Preparazione di derivati cristallini: permette di definire un punto di fusione più attendibile,

soprattutto nel caso di composti liquidi. 1

12. Confronto con i dati di letteratura;

13. Definizione esatta del composto.

ESAME ORGANOLETTICO

Colore

Lo sviluppo di colorazione è dovuto alla presenza di gruppi cromofori all’interno della struttura

chimica.

La colorazione può essere dovuta a diversi fattori:

1. Coniugazioni estese;

a. Sistemi aromatici coniugati;

b. Gruppi nitro: il gruppo nitro (R-NO ) non è generalmente cromoforo, ma conferisce

2

colorazione se legato a sistemi aromatici, sviluppando una colorazione giallo-rossa;

c. Gruppi nitroso: se legati a sistemi aromatici, i gruppi nitroso ne aumentano la colorazione;

d. Gruppi diazo: possibilità di avere composti trans maggiore rispetto alla forma cis. Il colore

varia a seconda della natura dei gruppi R;

forma trans forma cis

e. Gruppi chinoidi;

f. Composti policarbonilici: danno equilibrio cheto-enolico dove si ha la predominanza della

forma polienolica. La colorazione si sviluppa per l’avvento della tautomeria.

La colorazione può svilupparsi anche senza che le sostanze siano effettivamente colorate: ad

esempio, il fenolo (incolore) tende a imbrunirsi per ossidazione, se esposto all’aria, così come

l’anilina. 2

È quindi necessario saper distinguere l’origine della colorazione di una sostanza se proviene da

uno stato primordiale o da una sua modifica.

Odore

Le sostanze organiche possono presentare odori caratteristici che rispecchiano le peculiarità di

alcuni gruppi funzionali: si tratta di sostanze essenzialmente volatili, a basso peso molecolare,

liquidi o solidi a bassa temperatura di fusione.

Tra gli odori caratteristici si ricordano:

• Benzina: idrocarburi;

• Mandorle: aldeidi aromatiche;

• Pungente: acidi;

• Frutta acerba: esteri, aldeidi;

• Ammoniaca o pesce: ammine;

• Uova marce: zolfo.

Sapore

Sebbene sia un’analisi prescritta dalla Farmacopea, non è una buona prassi da perseguire.

Tuttavia, ponendo una punta di spatola di sostanza sulla lingua, è possibile riconoscere diverse

caratteristiche:

• Viscido o amarognolo: presenza di alcaloidi;

• Dolce: presenza di carboidrati;

• Amaro o viscoso: presenza di composti basici;

• Aspro o acido: composti acidi.

COMPORTAMENTO AL CALORE

Saggio al coccio di porcellana

Il saggio è condotto ponendo un’aliquota di campione su un coccio o su una lamina di porcellana

ed esponendolo alla fiamma.

Una volta esposto alla fiamma è possibile osservare diverse reazioni a seconda della natura

dell’analita:

• Composto organico: presenta almeno un carbonio con numero di ossidazione inferiore a

4+;

• Composto inorganico: presenta un carbonio con stato di ossidazione pari a 4+;

3

1. Composto metallorganico: presenta una classica struttura organica cui è collegato anche un

metallo. Esiste una sostanziale differenza tra sostanze metallorganiche e organometalliche,

infatti, mentre in un composto organometallico il metallo deve essere necessariamente

connesso al carbonio, non è necessaria questa distinzione per una sostanza metallorganica

e.g. sostanza metallorganica e.g. sostanza organometallica

Una volta che la sostanza è caricata nel coccio, viene preventivamente riscaldata e poi esposta alla

fiamma ed è possibile osservare diversi casi:

a. Sostanza che non brucia: campione inorganico;

b. Sostanza che brucia: campione organico;

c. Sostanza che brucia con residui: campione metallorganico.

Esistono anche alcune eccezioni a queste regole generali come:

• Zolfo o componenti contenente zolfo: bruciano;

• Na CO : fonde;

2 3

• NaCl: crepitii e fiammette scoppiettanti;

• NH Cl, HgO : sublimazione.

4 2

Occorre comunque tenere presente anche l’analisi della fiamma, molto importante in quanto:

• Fiamma gialla con margini bluastri: generalmente si tratta di una sostanza alifatica;

• Fiamma di colore più cupo e con fumi neri: è presente una sostanza aromatica.

Bisogna tenere comunque presente che la presenza di una miscela mostra contemporaneamente

delle caratteristiche delle sostanze aromatiche ed alifatiche, ad esempio una fiamma gialla con

pennacchi di fumo nero.

I fumi neri che si sviluppano sono residui carboniosi di una combustione non esaustiva:

• Fiamma scura con fumi neri: sicura presenza di una sostanza contenente nuclei aromatici;

• Falsi positivi:

1. Strutture polinsature coniugate con almeno tre doppi legami

2. Strutture policicliche con nucleo steroideo

In linea generale è possibile affermare che le sostanze organiche brucino meglio di quelle

metallorganiche ma il miglior metodo per determinarne l’origine risulta essere l’analisi del residuo

di combustione. 4

Se, infatti, non si ha residuo, si ha a che fare con una sostanza di origine organica, al contrario è un

composto metallorganico: mentre i composti organici producono ossidi volatili, i metalli delle

sostanze metallorganiche sono combusti ad ossidi del genere MO e M O, solubili in acqua a dare

2

idrolisi alcalina.

La procedura di identificazione è la seguente:

Dissoluzione Se pH>7 Saggio alla

del residuo allora fiamma per

di presenza di identificare il

combustione metallo metallo

Saggio del tubicino di vetro

Questo saggio è una alternativa al saggio del coccio in porcellana.

Il tubicino è chiuso ad un’estremità dove viene riposta la sostanza ed è poi posto sulla fiamma di

un bunsen e portato a riscaldamento, evitando di avviare la combustione.

Il vetro è spesso e, sotto agitazione, si possono osservare due distinti fenomeni:

• Formazione di un sublimato: cristalli della sostanza che evapora si depositano sulle pareti

della provetta. In questa classe rientrano:

o α-amminoacidi;

o Sali d’ammonio;

o Acidi aromatici;

o Arsenico (sublimato brunastro);

• Formazione di vapori: è possibile condurre tre tipologie di analisi sul colore, l’odore, il pH e

altre reazioni specifiche.

Quanto all’odore del vapore è possibile distinguere alcune peculiarità che sono indicatori della

presenza di una specifica sostanza:

a. Odore di caramello o carta bruciata: indice di presenza di carboidrati;

b. Odore agliaceo: presenza di arsenico; 5

1. Odore pungente o odore di sorbe (frutta acerba): nel primo caso, si ha a che fare con

l’acroleina, derivabile anche dalla degradazione della glicerina o di trigliceridi. Nel secondo

caso si ha il tipico odore dell’acetaldeide;

e.g. acetaldeide e.g. glicerina e.g. acroleina

2. Odore di mandorle: presenza di HCN, per cui occorre effettuare l’analisi elementare per la

ricerca di N. Bisogna tener presente che, in caso di presenza di odore di mandorle prima

del riscaldamento, si è in presenza di benzaldeide;

e.g. acido cianidrico e.g. benzaldeide

c. Odore di uova marce: presenza di H S, per cui occorre condurre l’analisi elementare per S;

2

d. Odore di ammoniaca: presenza di NH ;

3

e. Odore di zolfanello: presenza di SO .

2

Quanto al colore del vapore, esso è indicatore della presenza di alcune caratteristiche peculiari,

come:

a. Vapori incolore;

b. Vapori viola: tipici della presenza di iodio, spesso associati anche alla presenza di cristalli di

iodio sublimato;

c. Vapori giallo-brunastri: presenza di bromo.

È inoltre possibile andare a valutare il pH dei vapori, esponendo ad essi una cartina tornasole e

valutando il cambiamento di colore. NH

3

R-NH

2

Vapori basici R -NH

2

Vapori R -N

3

Cartina universale R-COOH e derivati

Vapori acidi Composti liberanti SO 2

Alogenoderivati che

subiscono

deidrogenazione

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Saggi specifici

Riconoscimento di HCN

Il riconoscimento di HCN è condotto per esposizione di una apposita

cartina ai vapori provenienti dal riscaldamento di un tubicino sul bunsen.

La cartina è imbevuta di acetato di benzidina e acetato rameico e vira al

blu se esposta a vapori di HCN: viene utilizzato l’acetato di benzidina

perché solubile in acqua.

La benzidina tende ad essere ossidata e, in presenza di sali di rame, si instaura un certo equilibrio

2+

tra la benzidina e Cu dove la benzidina può essere ossidata a dare la sua forma chinonica,

colorata di blu.

In assenza di fattori esterni, la reazione di equilibrio è spostata a sinistra, verso la benzidina:

-

l’aggiunta di CN porta a complessazione il rame che, venendo rimosso dalla reazione, sposta

l’equilibrio verso la forma chinonica, colorata di blu.

Poiché la forma chinonica risulta pressoché planare, grazie alla coniugazione quasi totale degli

orbitali π, si osserva una distanza molto piccola tra gli orbitali HOMO e LUMO: al diminuire della

distanza tra gli orbitali, si assiste ad un aumento degli orbitali π.

Le transizioni che avvengono tra HOMO e LUMO generano assorbimento di radiazioni

elettromagnetiche nel campo dell’UV, del visibile e dell’IR: laddove avvengano nel visibile, si

assiste al fenomeno della colorazione. 7

Quanto alla benzidina non ossidata non si vede il colore poiché, nonostante la coniugazione degli

orbitali π sembri analoga a quella della forma ossidata, sussiste un’importante tensione torsionale

che non permette la completa coniugazione. vs.

La forma colorata della benzidina non risulta essere la vera e propria forma chinonica ma l’addotto

che si forma tra la forma ossidata e la specie di partenza.

Riconoscimento SO 2

Come nel caso di HCN, il riconoscimento è condotto per esposizione di una specifica cartina ai

vapori del tubicino. In questo caso si utilizza come K Cr O come reattivo che, contenendo al

2 2 7

6+

suo interno Cr , estremamente cancerogeno, è disponibile solo sotto

cappa.

La reazione di viraggio del reattivo di Jones dal giallo-arancio al verde è

determinata dal passaggio di SO che genera una macchia derivante dalla

2

3+

presenza di Cr secondo la reazione

Riconoscimento H S

2

È facilmente riconoscibile anche dal singolo odore caratteristico di uova marce.

Anche in questo caso una apposita cartina è esposta ai vapori di

riscaldamento provenienti dalla sostanza e, nell’eventualità del

riconoscimento dell’acido solfidrico, viene preventivamente imbevuta di

Pb(OAc) o PbS.

2 8

È utilizzato l’acetato di piombo perché, derivando da un acido debole, darà idrolisi basica, mentre

il piombito di sodio è invece preparato in soluzione con NaOH.

Riconoscimento NH 3

Esistono sostanzialmente tre metodi per il riconoscimento di NH in un campione.

3

METODO N.1 È il metodo meno specifico, basato sull’utilizzo di una specifica cartina

imbevuta di reattivo.

Il reagente in questione è Cu SO che, esposto ai vapori del riscaldamento

2 4

del campione, vira da celeste a blu cobalto.

Questo tipo di analisi non è molto specifica poiché quasi tutte le ammine primarie e secondarie

riescono ad interagire con questo composto.

METODO N.2

Si tratta di un metodo altamente specifico per la determinazione della

presenza di NH in un composto.

3

È basato sul comportamento di una cartina di NaClO e fenolo esposta ai

relativi vapori di ammonio: a contatto con i vapori, si ha la formazione di

una colorazione indaco. -

In prima battuta, la reazione di ClO con NH genera clorammina e, per doppia ossidazione del

3

fenolo, parachinone.

In seguito, clorammina e parachinone possono reagire dando dapprima una base di Schïff, un

derivato imminico e, reagendo per SEAr con un altro fenolo, attaccandolo in posizione para,

secondo la seguente reazione. 9

1. Il p-chinone ha due carbonili piuttosto reattivi, reagisce con l’ammina clorurata

condensando e generando una base di Schiff;

2. Il composto ottenuto è molto reattivo e la sezione clorurata, elettrofila, genera SEAr in

para con l’altro fenolo;

-

3. Dato che ClO deriva da un acido debole, darò idrolisi basica permettendo la reazione non

tanto del fenolo quanto del fenato, molto più reattivo durante SEAr. Si ottiene un prodotto

con due forme di risonanza degeneri a pari energia detto indofenolo.

2

La colorazione è dovuta alla presenza di un N ibridato sp che ha un doppietto elettronico ed un

orbitale p in grado di fare da conduttore di coniugazione tra un anello e l’altro, nonostante i due

anelli non siano strettamente collegati l’uno all’altro.

METODO N.3

Questo metodo utilizza il reattivo di Nessler che, sfruttando l’ingombro sterico, rappresenta uno

dei primi saggi specifici utilizzati per il riconoscimento di ammoniaca.

È necessario innanzitutto preparare il reattivo per reazione di HgCl in KI in ambiente alcalino:

2 ecc.

La successiva esposizione del reattivo a NH favorisce la formazione di un

3

complesso, una sorta di “sale doppio” con una struttura ancora oggi fonte di

dibattito.

• Sale misto: specie diverse nel medesimo reticolo cristallino

e.g. ;

• Cloridrati: indica che la specie è il sale di un’ammina

e.g. 10

Riconoscimento acetaldeide

La decomposizione di sostanze come la glicerina origina acetaldeide,

riconoscibile tramite il saggio di Simmon.

Anche in questo caso è utilizzata una cartina imbevuta di apposito reattivo,

nello specifico una miscela di sodio nitroprussiato, morfolina o piperidina che,

a contatto con acetaldeide, permette l’osservazione della formazione di una

colorazione blu non visibile in presenza di NH , risultando essere un saggio

3

molto specifico.

Il meccanismo di reazione per questo saggio è ancora oggi dibattuto, tuttavia, è possibile

presuppore questo schema di reazione:

1. L’ammina secondaria reagisce con l’aldeide a dare un’enammina, specie stabile e neutra;

2. Il carbonio dell’enammina è nucleofilo, dato che lo spostamento di carica da N rende C

carico di elettroni;

3. L’attacco nucleofilo del nitroprussiato genera un complesso;

4. Distacco e ripristino dell’ammina e formazione del complesso di Simmon-Awe di colore blu.

Il complesso ottenuto -quello contenente il carbonile aldeidico- può essere scritto in forma

enolica:

Quello che è possibile osservare è l’azione chelante sul ferro e queste forme di risonanza possono

spiegare l’insorgenza della colorazione blu.

Il saggio di Simmon può essere utilizzato per individuare ammine secondarie a partire da

acetaldeide e nitroprussiato: in questo caso è denominato saggio di Simmon invertito.

11

Saggio con calce sodata

Questo saggio non permette di identificare direttamente la sostanza in esame, ma di separarle a

partire dal vapore estratto in soluzione acquosa.

Il campione iniziale è posto in provetta e addizionato di calce sodata in rapporto 5:1 con il

campione.

La calce sodata è una miscela alcalina di idrossido di calcio, di potassio, di sodio e acqua:

• Ca(OH) : 75%

2

• NaOH: 3%

• KOH: 1%

• H O: 20%

2

• Altro: 1%

Per riscaldamento si ha il rilascio di vapori basici che permettono un certo grado di idrolisi alcalina

a secco.

I vapori, tramite tubo a squadra o tubo a sviluppo,

intrappolati nell’acqua contenuta nel successivo vaso e

sottoposti ad analisi ulteriori.

Il saggio con calce sodata risulta particolarm