Analisi farmaceutica

VALIDITA’ DELLA LEGGE DI LAMBERT-BEER

È necessario stabilire se la legge è valida nelle condizioni di esperienza:

Cause strumentali (Rivelabili variando b a C constante):

• Non monocromaticità di I0.

• Diffusione o Riflessione.

• Radiazione Parassita*.

• Sorgente di luce instabile.

Cause di carattere chimico (Rivelabili variando la C):

• Associazioni e dissociazioni.

• Polimerizzazioni, Solvolisi.

• Variazioni di pH per acidi o basi deboli con e diverse.

• Solvente, Torbidità, T.



72- + 4--

Es. Cr O + H 0 2H + 2CrO

2 2

Si definiscono: DEVIAZIONI APPARENTI

Deviazioni positive o negative a seconda del prevalere di una delle due specie assorbenti e di quale si segue l’assorbimento.

In acqua, K Cr O si dissocia in ioni dicromato e in ioni potassio. In soluzione si instaura inoltre un equilibrio tra anione

2 2 7

dicromato e anione cromato, fortemente dipendente dal pH.

Se la soluzione è basica prevarrà l'anione cromato, giallino, mentre in soluzione acida prevale il dicromato, rosso. Le epsilon

sono diverse.

4-- + 72-

2CrO + 2H → Cr O + H 0 (giallo → arancio).

2 2

72- - 4--

Cr O + 2OH → 2CrO + H 0 (arancio → giallo).

2 2

Questo rapporto cambia marcatamente con la diluizione perché il pH si alza e l’equilibrio si sposta verso dx, causando una

pronunciata deviazione della legge.

Anche per acido benzoico (λ 273 nm ϵ = 970) e benzoato (λ 268 nm ϵ = 560): Diluendo o modificando il pH varia il rapporto

tra la [ ] delle due specie che, con ϵ diverse, daranno deviazione dalla legge. Per la misura della [ ], si fissa il pH per non

avere deviazione.

PUNTO ISOSBESTICO o ISOASSORBENTE

In alcuni casi non si può tamponare il pH per sostanze instabili o acidi poliprotici con stadi di dissociazione vicini tra loro:

l’esistenza di uno o più P.I. indica la presenza di due forme assorbenti in equilibrio tra loro (se ce n’è una terza deve avere

ϵ = 0 a quella λ).

ASSORBIMENTO DI SOLVENTI (CUT –OFF)

]

LEZIONE PER ENTRAMBI I CURRICULA

CON LA TECNICA DEL BICROMATISMO

Si possono determinare contemporaneamente anche DUE SOSTANZE DIVERSE in miscela nella stessa cella.

Es. miscela con più componenti, o seguire una reazione con più reagenti e un prodotto.

Effetto combinato, somma degli effetti di una e dell’altra a quella λ.

L’assorbanza della miscela di due sostanze è la SOMMA ESATTA delle assorbanze delle due sostanze lette singolarmente

(se non sono state diluite/concentrate e se non reagiscono).

Caso più semplice: I due componenti assorbono a 2 λ diverse, i loro spettri sono completamente separati.

Se le 2 sostanze cominciano ad assorbire nel range di λ di una o dell’altra, gli spettri si sovrappongono: l’effetto è combinato,

ma non si sa quanto una contribuisca all’altro spettro (assorbanza più alta).

→ meglio separare le sostanze.

Due componenti in miscela: x e y, dove y assorbe anche alla λ1 di x, ma x non assorbe alla λ2 di y.

Dapprima si calcola la C di y (alla sua λ ):

2

Non si considera l’assorbimento di x alla λ poiché ϵ di x alla λ è trascurabile.

2 2

Le ϵ di x e y sono note.

Per sapere Cx si sottrae il contributo di y.

MISURE IN BICROMATISMO

Spesso invece abbiamo reazioni complesse (che contengono anche enzimi) e tutte le specie in soluzione contribuiscono

all’assorbimento, sarebbe necessario fare un bianco, con tutti reattivi alle giuste concentrazioni, per poter azzerarle

(consumo di tempo e materiale).

→ si utilizza la TECNICA DEL BICROMATISMO: dove possibile, si attua la misura a 2 diverse lunghezze d’onda, sullo stesso

campione:

Linea tratteggiata: altra sostanza che contribuisce all’assorbimento (specie interferente) → l’assorbimento,

corrispondente al picco della specie di interesse, risulta maggiore.

La specie interferente deve assorbire allo stesso modo alle λ diverse (ha ϵ uguali): così è possibile sottrarre la sua

assorbanza (alla λ alla quale la specie di interesse non assorbe) alla assorbanza della miscela.

→ picco o spettro corrispondente alla sola specie di interesse.

Nel secondo caso invece, l’assorbimento della specie interferente, all’altra λ è minore del contributo che porta alla

miscela → sovrastima (perché si sottrae meno dell’assorbanza giusta).

BIANCO CAMPIONE= azzeramento con una miscela contenente il campione e i reagenti, escludendo quello principale che

porta alla formazione del CROMOFORO.

Es. dosaggio glucosio con UV test:

lettura bicromatica a 340 e 383 nm

• 340 nm: lettura NADPH.

• 383 nm: lettura altre specie (per azzerare).

SPETTROFOTOMETRIA

DI ASSORBIMENTO ATOMICO

È una delle tecniche più usate per l’analisi degli ELEMENTI IN TRACCE, soprattutto METALLI, in DIVERSE MATRICI (acque,

terreni, campioni biologici, alimenti, leghe metalliche).

Viene usata quasi esclusivamente per L’ANALISI QUANTITATIVA: perché in assorbimento si utilizzano lampade che

emettono radiazioni a righe, provocate dai metalli di cui noi poi andremo a determinare l’assorbimento nel campione

(concentrazione incognita, ma metallo noto).

PRINCIPIO DI BASE: assorbimento di radiazioni da parte di ATOMI, nello specifico di metalli (differenzia dalla

spettrofotometria di assorbimento).

Anche spettrofotometria di EMISSIONE ATOMICA (fluorescenza atomica), poco usata come tecnica.

APPLICAZIONI IN CAMPO BIOTECNOLOGICO, NELLO STUDIO DI METALLOPROTEINE

• I metalli hanno funzioni strutturali e funzionali (es. catalitiche negli enzimi, le METALLOPROTEASI).

• EMOCIANINE: emoglobine che legano Fe e Cu.

• CERULOPLASMINA: proteina che lega Fe e Cu, coinvolta nel metabolismo di Fe e Cu, responsabile della malattia di

Menkes. Malattia di Wilson (Cu).

• FATTORE VIII della coagulazione (è esso stesso un farmaco), lega Ca e 2 atomi di Cu.

• METALLOTIONEINE: proteine detossificanti tramite i residui di Cys.

• ZINC FINGERS: DNA binding proteins, il metallo mantiene il folding dei fattori di trascrizione.

• INSULINA: lega lo Zn con cui dà un esamero.

METALLOPROTEINASI E METALLOPEPTIDASI

Le metalloproteinasi e metallopeptidasi sono coinvolte in molti PROCESSI sia FISIOLOGICI che PATOLOGICI.

Le METALLOPROTEINASI DI MATRICE (MMPs) sono una famiglia di enzimi coinvolti in numerosi processi fisiologici e

patologici metastatici ed angiogenetici concernenti la matrice extracellulare (ECM), quali lo sviluppo, l’infiammazione, la

crescita e l’invasività tumorale.

PROTEINE METALLOPORFIRINICHE sono una categoria delle metalloproteine nelle quali il gruppo prostetico è costituito da

uno ione metallo (Fe, Mg, Co, Ni, Cu, Zn) e una porfina.

APPLICAZIONI IN CAMPO SANITARIO

++ + +

• Nel DOSAGGIO di IONI Ca , K , Na per dialisi peritoneale, emodialisi ed emofiltrazione - FUI XI.

• Nella DETERMINAZIONE dei RESIDUI METALLICI presenti nei farmaci alla fine del processo di produzione.

• Nell’ANALISI DEI METALLI nei fluidi biologici (intossicazioni, livelli fisiologici).

ASSORBIMENTO ATOMICO

Per determinare la quantità di un elemento:

• Si ATOMIZZA il campione.

• Si ECCITANO gli atomi con opportune λ.

• Si MISURA la radiazione assorbita.

FORMAZIONE DI ATOMI DELL’ELEMENTO DA ANALIZZARE :

Il campione può essere un semplice liquido oppure presente in matrice (biologica, forma farmaceutica, terreno) complessa.

La presenza del campione in una matrice troppo complessa, può essere un problema per fare l’analisi.

Se il metallo è sottoforma di sale, bisogna renderlo atomo, perché il metallo sottoforma di ione non riesce ad assorbire la

radiazione luminosa.

Per formare ATOMI LIBERI sul cammino della radiazione eccitante, si riscalda in modo energico il campione (si utilizzano

temperature elevatissime) per mezzo di:

a. FIAMMA: Comburente + combustibile → T diverse.

Utilizzo di campioni in forma liquida (spruzzati all’interno della fiamma).

La fiamma stessa emette radiazioni luminose (non confondere con quelle derivanti dalla sorgente

(radiazioni da assorbire).

b. FORNETTO DI GRAFITE: metodica recente.

Attraverso una scarica elettrica, si scalda la grafite a tal punto da ottenere temperature molto elevate.

Si possono analizzare campioni liquidi ma anche solidi.

INVIO DI RADIAZIONI LUMINOSE AGLI ATOMI FORMATI

:

Un atomo, colpito da radiazioni elettromagnetiche di una ben PRECISA FREQUENZA (UV/vis), può assorbire energia e

passare ad uno STATO ECCITATO: uno degli elettroni esterni acquista energia e va ad occupare un orbitale a maggiore

energia.

Quasi immediatamente, l’elettrone ritorna nell’orbitale di partenza e l’atomo cede l’energia assorbita all’ambiente

circostante: il RILASSAMENTO (QUENCHING) avviene prevalentemente per VIA TERMICA (urti con altre particelle); una

piccolissima frazione dà origine ad EMISSIONE SECONDARIA di energia radiante (FLUORESCENZA ATOMICA).

Ora, lo spettro emesso dai vapori caldi di una sostanza, può essere costituito da un SINGOLO COLORE, come accade per il

giallo nelle lampade a vapore di sodio, il rosso nelle lampade al neon, il blu-verde nelle lampade a vapori di mercurio.

In questi casi, lo spettro consiste di VARIE RIGHE, ciascuna relativa a una SPECIFICA LUNGHEZZA D’ONDA, separate una

dall’altra da regioni di completa OSCURITÀ. 2 2 6

Prendiamo in considerazione lo spettro caratteristico dei VAPORI DI SODIO (Na, 11 elettroni, configurazione: 1s , 2s 2p

1

3s , l’elettrone interessato alla transizione è quello di valenza, ovvero quello che si trova nel guscio più esterno).

Le transizioni degli elettroni, sono NETTE → gli spettri (eccitazione, assorbimento e emissione) sono a righe, le quali

corrispondono alle lunghezze d’onda necessarie da assorbire, per poter fare il salto elettronico.

• Il campione deve essere portato in SOLUZIONE (generalmente acquosa).

• La soluzione viene aspirata e nebulizzata (AEROSOL) nella fiamma (bruciatore) → evaporazione solvente,

distruzione della matrice.

• Il metallo si ESSICCA (con il proprio contro ione, molecola che non assorbe), con l’aumento della temperatura il sale

0

FONDE, diventa liquido e infine GAS (vapore atomico, dissociazione omolitica della molecola in atomi liberi) M .

Importante TEMPERATURA per l’atomizzazione (T diversa per diversi elementi, una temperatura superiore lo renderebbe

ione, perdita elettroni (stato eccitato)), tecnica quantitativa.

FORNETTO:

• Stessi passaggi, fenomeni, ma non avviene la nebulizzazione della soluzione.

• Viene direttamente inviata la radiazione luminosa.

CONSIDERAZIONI GENERAL