Analisi farmaceutica

Antiga Alessia 2017 Analitica Farmaceutica UniPD – prof. Miolo

Metodi analitici spettroscopici

• Spettrofotometria UV-vis
• Fluorescenza
• Assorbimento atomico: Radiazioni assorbite da atomi (non molecole) di metalli. Analisi farmaceutica di un metallo es. Fe, Hg, per quantità tossicologica dei metalli, all'interno di metallo proteine. Qualitativa e quantitativa.

Spettrofotometria UV-vis

Per studiare direttamente le sostanze, dal punto di vista qualitativo e quantitativo, ma anche come metodologia per seguire delle reazioni di ligazione con sostanze che possono essere lette allo spettrofotometro (reazione ligando-anticorpo, reazioni enzimatiche, di metaboliti, tra sostanza che non assorbe, ma una volta trasformata in prodotto assorbe, DNA con sostanze intercalanti fluorescenti).

Capacità sostanze di assorbire radiazioni luminose (UV-visibile) ed eventualmente emissione di radiazioni (luminescenza).

Radiazione

Propagazione di energia attraverso lo spazio, in forma di onde, costituite da particelle, fotoni (quanti di energia).

Radiazione elettromagnetica

Sistema di onde con componente elettrica e magnetica, perpendicolari tra loro ed alla direzione di propagazione (alla velocità della luce). → 3 vettori (energia, componente magnetica, direzione propagazione).

Radiazioni elettromagnetiche non ionizzanti (NIR)

Radiazioni e.m. la cui energia non è sufficiente ad estrarre elettroni da un atomo o da una molecola (fenomeno della ionizzazione). Quelle ottiche (UV- vis) sono non ionizzanti: hanno minor energia, gli elettroni degli atomi e delle molecole, fanno salti elettronici, ma non riescono ad essere estratti.

Ionizzanti: Alta energia, riescono ad estrarre elettroni e produrre ioni. Metodi analitici spettroscopici si basano sullo scambio di energia, interazioni, tra la radiazione elettromagnetica e la materia. Questo tipo di interazioni sono evidenti ad occhio nudo nel caso di radiazioni che cadono nel campo visibile (colori).

La radiazione elettromagnetica viene considerata come una forma di energia radiante dotata di una doppia natura, ondulatoria e corpuscolare: Le radiazioni elettromagnetiche sono onde caratterizzate da una lunghezza d'onda (λ), da un'ampiezza e da una frequenza (ν). Si possono considerare come un fascio di particelle chiamati quanti o fotoni.

Fotone

• Il fotone rappresenta l'unità particolata delle radiazioni.
• Il quanto è la quantità di energia contenuta in un singolo fotone.

In ogni momento il vettore campo elettrico È e il vettore campo magnetico H sono fra loro perpendicolari e perpendicolari anche alla direzione di propagazione X. OZ’ = ampiezza del vettore elettrico. OY’ = ampiezza del vettore magnetico. AA’ = lunghezza d’onda = λ.

Campi magnetici

• Sono prodotti dalle cariche elettriche in movimento.
• La loro intensità si misura in Ampere al metro (A/m) o in Tesla (T).
• I campi magnetici sono massimi vicino alla sorgente e diminuiscono con la distanza.
• Non vengono schermati dalla maggior parte dei materiali di uso comune.

Campi elettrici

• Sono prodotti dalle cariche elettriche.
• La loro intensità si misura in V/m.
• L'intensità dei campi elettrici è massima vicino alla sorgente e diminuisce con la distanza.
• Possono essere schermati da alcuni comuni materiali (legno, metallo).

Lo spettro elettromagnetico

• Raggi gamma.
• Raggi X.
• UV 180-200 → 380-400 nm radiazioni con maggiore energia di quelle del visibile, provocano perturbazioni diverse.
  • UVA: 315 – 400 nm.
  • UVB: 280 – 315 nm.
  • UVC: 100 – 280 nm. Artificiali, usate anche a fini analitici.
• Visibile 380-400 nm → 780-800 nm.
• Infrarosso: 780 nm → 1 mm.
  • IRA: 780 – 1400 nm.
  • IRB: 1400 – 3000 nm.
  • IRC: 3000 nm – 1 mm.
• Microonde.
• Onde radio.

Radiazioni ottiche

Comprese tra ultravioletto e infrarossi: 100 nm → 1 mm. Classificate in:

• Coerenti: radiazioni artificiali, che emettono un fascio perfettamente monocromatico (specifica λ). Comprendono anche i raggi laser.
• Non coerenti: tutte le radiazioni ottiche che non sono laser.

Sono suddivise in:

• Radiazioni ultraviolette.
• Radiazioni visibili.
• Radiazioni infrarosse.

Radiazioni ultraviolette

Effetti biologici

• Cute: Lesioni di tipo eritematoso a carico delle parti scoperte. Una amplificazione della risposta cutanea è causata da agenti fotosensibilizzanti presenti in essenze vegetali e da agenti fotoallergizzanti (tetracicline, sulfamidici, FANS, antidepressivi, diuretici, cosmetici, distillati del catrame, coloranti, etc.): radiazioni (esposizione prolungata) e farmaci (orali o topici). Gli effetti cronici sono causati da aumento delle fibre elastiche, con diminuzione del collagene e atrofia dell'epidermide, cui si associano metaplasia cellulare con possibili esiti in neoplasia.
• Occhio: Luce solare o lampade artificiali. Gli effetti oculari possono essere transitori (si sviluppano entro 6-12 ore con congiuntivite e cheratite e scompaiono entro 24-48 ore) e permanenti. Per λ comprese tra 295 e 325 nm (regione spettrale UV-B) vi è il rischio di insorgenza della cataratta. Farmaci che si distribuiscono anche a livello dell'occhio o somministrazione oculare. Farmaci esposti alla luce solare o luci artificiali, es. neurolettici, durante la preparazione stessa, cambiano subito colore o subiscono modifiche importanti → perdono attività o sono trasformate in molecole tossiche, dando effetti collaterali.

DPI occhi e visolenti a contatto: è sconsigliato utilizzarle in laboratorio. In caso di contaminazione devono essere prontamente rimosse e non riutilizzate.

Metodi analitici spettroscopici

Si basano sullo scambio di energia tra la radiazione elettromagnetica e la materia.

• Proprietà della luce.
• Struttura elettronica delle molecole: proprietà particolare, distribuzione elettroni negli orbitali soprattutto esterni. Non tutte le molecole reagiscono alle radiazioni luminose.
• Interazione di fotoni con le molecole.

Proprietà della luce: Il fotone

La base teorica dell'interazione tra radiazione e materia è la natura quantica del trasferimento di energia. Il carattere ondulatorio della radiazione può essere descritto da:

• Lunghezza d'onda (λ): distanza tra le due creste dell'onda.
• Frequenza (ν): Numero di oscillazioni complete che l'onda fa per ogni unità di secondo. Espressa in numero di oscillazioni/sec o s^-1 o in Hertz (Hz).

La velocità della luce nel vuoto è C = 2,998 x 10⁸ m·s^-1. Tutte le onde elettromagnetiche (indipendentemente dalla loro λ, E e ν) si propagano nel vuoto con la stessa velocità: velocità della luce: ≈ 3 x 10⁸ m•sec^-1. La radiazione elettromagnetica trasporta una quantità di energia (E) inversamente proporzionale alla sua lunghezza d'onda:

ℎ = ℎ = h = Planck’s constant (6.626 x 10^-34 J·s). Ē= energia in un quanto (Kcal).

Transizioni elettroniche

Per atomi e molecole che assorbono radiazioni nel campo UV-Visibile, l'eccitazione degli elettroni provoca il loro passaggio ad un livello a energia superiore. La transizione avviene quando:

• La radiazione ha l'esatta energia per coprire il salto energetico: ogni orbitale ha la propria energia e l'elettrone che vi si trova ha quella esatta energia → necessaria energia che corrisponde esattamente alla differenza di energia tra i 2 orbitali successivi.
• Si verifica una variazione del momento di dipolo.

Le radiazioni UV e vis, una volta che interagiscono con la materia, in base alla loro energia, ben specifica, riescono al massimo ad interagire con gli elettroni esterni e provocarne delle transizioni energetiche (saltano a riempire orbitali che normalmente non sono occupati). Gli infrarossi, che hanno minor energia, riescono a provocare semplicemente delle oscillazioni (che possono essere lette e misurate, utili per capire la struttura di una molecola → tecnica IR).

Affinché una radiazione induca una transizione elettronica in un atomo o in una molecola, la sua Ē deve corrispondere esattamente alla differenza tra i 2 stati energetici dell'atomo (o della molecola).

Ciò che differenzia gli spettri tra spettrofotometria UV-Vis molecolare e atomica è che un atomo ha orbitali con energie ben definite, quantizzate, quindi le radiazioni assorbite hanno energie ben definite.

Transizioni elettroniche in un atomo

Lo spostamento di elettroni in un atomo avviene con variazioni di energia definite, quantizzate: sono possibili solo salti elettronici da un orbitale all'altro (stati elettronici fondamentali, gli atomi non hanno sotto livelli rotazionali e vibrazionali). Anche la radiazione è formata da fotoni cui corrispondono quanti discreti di energia, proporzionale alla frequenza della radiazione.

Spettri discreti (a righe) o a bande (continui) provano gli stati quantizzati di energia della materia e i trasferimenti quantizzati di energia tra radiazione e materia.

Spettri discreti (a righe)

• Spettro continuo: insieme di radiazioni.
• Spettro assorbimento a righe: L'atomo ha assorbito determinate radiazioni → spettro con righe scure, non visibili perché l'atomo le ha assorbite.
• Spettro di emissione a righe: spettro con righe visibili, corrispondenti alle radiazioni assorbite e successivamente emesse.

Transizioni elettroniche in molecole

Gli elettroni delle molecole possono anche ruotare e vibrare → anche la posizione e l'energia degli orbitali molecolari, così assumono diversi livelli → sotto livelli vibrazionali + sotto livelli rotazionali = sotto livelli energetici in cui possono posizionarsi gli elettroni. Quando una molecola è colpita da un fascio di radiazioni, avendo molti sotto livelli, potrà assorbire un numero maggiore di radiazioni per coprire più salti → spettri a bande. Ē totale = Ē elettronica + Ē vibrazionale + Ē rotazionale.

Spettri di assorbimento UV-vis

È il complesso di radiazioni monocromatiche che un composto è in grado di assorbire. Ogni sostanza o molecola ha un suo spettro di assorbimento in base ai gruppi cromofori presenti. Si rappresenta graficamente riportando la quantità di luce assorbita (A) in funzione di λ.

Cromofori

I gruppi che hanno assorbimento caratteristico si chiamano cromofori (dal greco, portatori di colore). Possono essere isolati o più di uno (interazioni tra cromofori determinano un particolare spettro di assorbimento). Alcuni sono visibili con lo spettrofotometro, altri no come quelli a 180 nm (limiti strumentali). Le transizioni tra i differenti livelli energetici degli elettroni esterni negli atomi e nelle molecole hanno energie simili a quelle dei legami chimici, dell'ordine delle centinaia di kJ/mol. Queste energie corrispondono a frequenze e lunghezze d'onda nelle regioni spettrali della luce visibile e dell'ultravioletto vicino e lontano.

[Piano farmaceutico Negli atomi gli elettroni hanno la massima probabilità di trovarsi in orbitali che si differenziano per energia, forma e orientazione.

Effetto della struttura sull'assorbimento

Nelle molecole invece sono presenti gli orbitali molecolari fra i quali avvengono le transizioni elettroniche. Gli orbitali molecolari allo stato fondamentale sono gli orbitali di legame di tipo σ: oppure orbitali di legame di tipo π. Inoltre si hanno orbitali occupati da doppietti elettronici su eteroatomi come ossigeno ed azoto, chiamati orbitali non leganti di tipo η. Infine si hanno orbitali antileganti ad energia maggiore di tipo σ* oppure π*.

Un orbitale molecolare è un orbitale esteso a due o più atomi uniti da un legame covalente. Si può visualizzarlo come il prodotto della fusione per sovrapposizione di due orbitali atomici. Quando la sovrapposizione avviene lungo la congiungente i due nuclei, l'orbitale molecolare prende il nome di σ. Quando la sovrapposizione avviene perpendicolarmente all'asse che unisce i due nuclei, ovvero sopra e sotto i medesimi, l'orbitale molecolare prende il nome di π.

Livelli di energia elettronici

Transizioni elettroniche

Le transizioni elettroniche comunemente osservate nella regione UV-visibile sono di tipo n → π*, n → σ* e π → π*. Le altre transizioni, come per esempio quelle σ → σ* tipiche di legami C-C o C-H, avvengono tra livelli energetici molto distanti e quindi nella regione dell'UV lontano.

Cromofori

I gruppi che hanno assorbimento caratteristico si chiamano cromofori (dal greco, portatori di colore). In tutti i composti diversi dagli alcani, gli elettroni possono andare incontro a parecchie possibili transizioni di energie diverse. Alcune delle più importanti transizioni sono:

• Non sono osservabili tutte le transizioni perché esistono delle regole di selezione dovute a:
  • Cambio nel n. quantico di spin;
  • n° di elettroni eccitabili nello stesso tempo;
  • Proprietà di simmetria della molecola.

N.B. alcune si osservano ugualmente ma con assorbimenti più bassi (es. n → π*). Le transizioni elettroniche che si possono verificare in una molecola organica, a seguito dell'assorbimento di luce, sono rappresentate nella tabella:

Negli alcani

Occorrono Energie troppo elevate e quindi lunghezze d'onda troppo basse per i nostri spettrofotometri (< 200 nm).

Nelle molecole insature

Occorrono Energie elevate (alcheni ~175 nm, alchini ~ 170 nm, C=O ~ 188 nm), ma le lunghezze d'onda sono adeguate per i nostri spettrofotometri (> 200 nm) soprattutto quando sensibili ai sostituenti.

Formazione degli orbitali molecolari nell'etilene

N.B. La teoria degli Orbitali Molecolari spiega perché all'aumentare della coniugazione diminuisce l'energia richiesta per l'eccitazione elettronica (vedi più avanti) In molecole sature con atomi aventi coppie di elettroni spaiati Ad alta energia, difficilmente osservate perché coperte dai solventi che vengono impiegati per sciogliere le sostanze stesse, soprattutto quelle di alcoli e ammine (170-200 nm), tioli e solfuri (200-220 nm).

Transizioni osservabili per un gruppo carbonilico C=O

Cromofori

• Nel caso dell'acetone (CH₃)₂C=O la transizione π→ π* assorbe a λ = 188 nm con ε = 90, mentre la transizione n→π* assorbe a λ = 279 nm con ε = 1.5.
• Per il gruppo cromoforo formato dal doppio legame C=C olefinico si osserva un'intensa caratteristica transizione π→π*; ad esempio il pent-1-ene CH₃CH₂CH₂CH=CH₂ assorbe a λ = 190 nm con ε = 1000.
• Nel caso di cromofori coniugati l'energia di transizione diminuisce, cioè la lunghezza d'onda aumenta rispetto ai valori dei cromofori separati (è il cosiddetto spostamento batocromo), e anche il coefficiente ε aumenta.
• Così nel butadiene CH=CH-CH=CH₂, contenente due cromofori C=C coniugati, la transizione π→π* si osserva spostata a λ = 217 nm con ε = 2100.
• Nel benzene e in altri aromatici l'effetto è ancora più marcato.

Energie di alcune frequenze spettrali

La colorazione delle sostanze naturali è dovuta a transizioni elettroniche. Se sono presenti molti cromofori coniugati lo spostamento verso le alte λ può raggiungere la regione del visibile. Per esempio il β-carotene, pigmento arancione contiene undici cromofori C=C, assorbe nel visibile a λ = 450 nm con ε = 15000. Nel caso della clorofilla (verde), si ha assorbimento di radiazione visibile blu e rossa → quindi il colore verde che si osserva è dovuto alla radiazione non assorbita.

Effetto del solvente sull'assorbimento

Il solvente instaura con le molecole dei legami che influenzano le Energie degli stati fondamentali e/o eccitati, per cui cambiano le energie necessarie per le transizioni elettroniche e quindi le lunghezze d'onda assorbite, ma anche il numero di transizioni può essere modificato. Anche il solvente assorbe radiazioni, sovrapponendosi alle lunghezze d'onda delle sostanze scioltevi.

Diagramma schematico dello spettro elettromagnetico

Si noti che la scala delle λ non è lineare; i valori numerici possono variare a seconda delle convenzioni adottate. Nuclei atomici (tra cui H, C) immersi in un forte campo magnetico possono variare il loro 'momento magnetico'; le energie connesse a tali transizioni sono invece basse, e corrispondono a quelle delle onde radio. La tecnica basata su tale principio si chiama spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) ed ha applicazioni nello studio ed identificazione di molecole organiche (nonché di imaging in campo medico). Le microonde inducono rotazioni nelle molecole. Le radiazioni infrarosse (spettrofotometria IR) amplificano le oscillazioni dei legami. Le radiazioni nel campo dell'UV-Visibile eccitano gli elettroni più esterni (elettroni di legame) degli atomi o delle molecole. L'energia degli elettroni interni è quantizzata e le radiazioni in grado di effettuare le relative transizioni cadono nel lontano ultravioletto o nei raggi X.

Radiazioni non ionizzanti

Sono onde elettromagnetiche di energia inferiore a 10 eV (energia necessaria a spostare un elettrone dall'orbita periferica):

1. Radiazioni ultraviolette.
2. Radiazioni del campo visibile.
3. Radiazioni infrarosse.
4. Microonde.
5. Radiofrequenze.
6. Radiazioni prodotte dai LASER.

Lezione per entrambi i curricula spettrofotometro è lo strumento di laboratorio