Analisi biochimica

DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE O VOLUME IDRODINAMICO

Anche tramite altre tecniche a bassa risoluzione, come elettroforesi (SDS-PAGE), centrifugazione frazionata su gradiente.

Si operano 2 corse:

• 1 contenente proteine con peso molecolare noto: Per ciascuna proteina si calcola il K o si utilizza il volume

d

eluizione, poi costruisco il sistema di assi cartesiani → K con log PM.

d

Ottengo retta di taratura con una precisa equazione.

• 1 contenente proteine con peso molecolare ignoto.

TARATURA:

Plot of the elution volume (Ve) versus the log of molecular weight of standard proteins ( ) and of hGH, fragment 45–191

and fragment 1–44 in the presence and absence of heme ( ). Gel filtration experiments were performed using a Superdex-

75 column (type HR 10/30, 1 x 30 cm; Pharmacia) equilibrated and eluted with 20 mM Tris HCl/0.15 M NaCl, pH 7.5, at a

flow rate of 0.4 mL/min.

Assorbanza: la lunghezza d’onda a cui si lavora dipende dalle caratteristiche importanti dei residui delle proteine.

 280 per proteine con strutture aromatiche.

 226 per legame peptidico (va bene per tutte le proteine) (206 → 226 legame ammidico).

CAMBIO CONCENTRAZIONE DELLE SOLUZIONI

Tramite eluizione (dinamica):

• Carico ampio volume → raccolgo frazione ridotta.

• Raccolgo frazione in un altro buffer.

DESALTING :

Eluizione con un tampone o un eluente diverso da quello in cui è sciolta la proteina di interesse.

Per eliminare il sale (buffer), che in generale pesa meno di una proteina, permette di raccogliere la proteina (de-salting) o

per cambiare solvente.

Condizioni necessarie: acqua distillata o miscela acqua-sostanza volatile che evapora facilmente.

È possibile utilizzare anche la dialisi o la cromatografia a fase inversa.

SEPARAZIONE DI MONOMERI E DIMERI

Column: Superdex 75 HR 10/30

Sample: A special preparation of rhGH in distilled water

Es. Emoglobina tetramerica.

Colonna e condizioni scelte opportunamente → diversi picchi:

• In condizioni native esce con un unico picco (proteina tetramerica).

• In condizioni denaturanti, la proteina esce come subunità (2 dimeri).

REFOLDING OSSIDATIVO

Eluizione con tampone di refolding, pH 7.5.

Utilizzo di miscela del campione con condizioni denaturanti e condizioni sperimentali (tampone) che favoriscono il re-

folding, soprattutto tramite riformazione dei ponti disolfuro.

Dentro la colonna si attua un processo di scambio del solvente (diluizione sempre maggiore lungo la colonna) che permette

l’apertura e chiusura dei ponti fino ad ottenere la forma ossidata della proteina → picco distinto da tracce della proteina

ancora ridotta o parzialmente ridotta.

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CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA RP-HPLC

Colonne di tipo ANALITICO: diametro piccolo, maggiore risoluzione, campione più piccolo.

FINGER PRINTING= mappa di una proteina: possibilità di identificazione attraverso l’analisi dei suoi peptidi.

CROMATOGRAFIA IN FASE NORMALE:

• FASE STAZIONARIA di tipo idrofilico.

• ELUENTE non polare: solventi organici come esano, metilen-cloruro.

40 anni fa.

CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA:

• FASE STAZIONARIA idrofobica.

• ELUENTE miscela polare/non polare.

TEORIA DELLA FASE INVERSA

La cromatografia in fase inversa si basa sull’INTERAZIONE IDROFOBICA REVERSIBILE tra le molecole di soluto presenti nella

fase mobile ed i ligandi immobilizzati nella fase stazionaria.

La distribuzione dei componenti del campione tra fase mobile e fase fissa dipende dalla loro rispettiva SOLUBILITÀ.

A parità di matrice alcune sostanze si legano in modo più forte (sostanze più idrofobiche) → Aumentano l’idrofobicità

dell’eluente posso staccare tutte le sostanze.

RPC è la tecnica di separazione più popolare su scala analitica, in quanto:

• È COMPATIBILE con l’analisi di una vasta gamma di molecole, cariche, polari e apolari.

• Consente un CONTROLLO PRECISO di variabili come tipo di solvente organico e concentrazione, pH e temperatura.

• Le colonne RPC sono EFFICIENTI e STABILI.

• È una TECNICA ROBUSTA.

TEORIA

Le molecole d’acqua adiacenti alla superficie idrofobica sono disposte in modo altamente ordinato. L’alterazione di questo

strato di acqua “ordinata” porta ad una situazione, termodinamicamente più favorevole, in cui si osserva un aumento di

entropia, associato alla interazione idrofobica.

EQUIPAGGIAMENTO

• COLONNE: acciaio, per sopportare pressione interna elevata, dalle pompe.

• MATRICI: 2 tipi principali.

• GRUPPI FUNZIONALI.

• SOLVENTI.

• STRUMENTAZIONE.

MATRICE

Le matrici commercialmente disponibili sono costituite da SILICE o POLIMERI ORGANICI SINTETICI come polistirene,

funzionalizzate con dei LIGANDI IDROFOBICI.

• Silice-based RPC:

o Silice porosa per aumentare la superficie effettiva.

o Particelle inattive.

o La fase idrocarburica può variare nella lunghezza delle catene tra C2-C18.

o È completamente stabile al range di pH 2-7,5.

• Polymer-based RPC:

o Polimero poroso per aumentare la superficie effettiva.

o Particelle non polari attive.

o Fase non legata.

o Stabile a range di pH 2-11.

Importante il RANGE DI STABILITÀ.

Silice – SiOH

Struttura base di particelle di Si-OH.

Le FUNZIONI IDROSSILICHE devono essere FUNZIONALIZZATE con LIGANDI aventi CATENE ALCHILICHE, es:

• C2: non si usa più.

• C4: 4 atomi di C. es. per proteine.

• C8.

• C18: interazione idrofobica più spinta. Spettro di selettività più ampio. Es. per peptidi.

Scelta ligando in modo da realizzare interazioni adatte a tutte le sostanze, specifiche con tutte le componenti: se scelgo

C18, da interazione idrofobica più spinta, rischio di non riuscire a slegare le sostanze con l’eluente, ma offre uno spettro di

sensibilità più ampio.

Le particelle di silice hanno un DIAMETRO ed una POROSITÀ:

Fase stazionaria polimerica - PVS/DVB

Presentazione della resina polimerica: polivinil-stirene e divinil-benzene.

Porosità e compattezza → Stabile in un ampio range di pH, bassa retro-pressione.

SELETTIVITÀ

FASE MOBILE

A differenza della cromatografia in gel di filtrazione, qui si utilizza come eluente, una MISCELA di 2 SOSTANZE, in GRADIENTE

(si inizia con un solvente idrofilico e si aumenta man mano la concentrazione della specie idrofobica).

SOLVENTE A:

• Normalmente ACQUA, priva di sale e di forza ionica.

• TETRAIDROFURANO (THF).

SOLVENTE B organico:

• ACETONITRILE: più utilizzato.

• ETANOLO.

• METANOLO.

• ISOPROPANOLO: più idrofobico.

La scelta dipende anche da:

• TRASPARENZA SISTEMI DI RIVELAZIONE: eluente che assorbe sostanze da separare crea problema → segnale di

background (no quantitativa).

• BACK PRESSURE generata sulle pompe: dipende da come è sistemato lo strumento.

• pH dell’eluente.

• ION PAIRING.

Es. isopropanolo trasparente fino a 210 nm.

Es. Acetonitrile meno problemi di retro pressione allo strumento (low viscosity) e buona trasparenza.

POTERE ELUENTE di solventi organici= capacità di rimuovere le sostanze dalla matrice.

Methanol < Ethanol < Acetonitrile < iso-Propanol

Elution profiles

Pressure profiles

ION PAIRING AGENT [domanda]

Normalmente separazioni a pH acido→ i peptidi si protonano.

Necessario risaltare l’interazione idrofobica e non quella ionica: aggiunta agli eluenti (entrambi) di una sostanza che crea

uno schermo sulle cariche (non sale).

Aggiunta di quantità minime (0,2-0,05% per L), non degrada i peptidi.

PEPTIDI E PROTEINE (NORMALMENTE CARICHI POSITIVAMENTE):

• -

Trifluoroacetic acid (TFA): -CF -COO

3

• -

Pentafluoropropionic acid (PFPA): -CF -CF -COO

3 2

• -

Heptafluorobutyric acid (HFBA): -CF -CF -CF -COO

3 2 2

+ -

Si dissocia → gli H protonano il peptide e COO maschera la carica +.

È volatile: quando la frazione HPLC contenete il peptide di interesse viene liofilizzata, questa sostanza è la prima ad essere

eliminata, poi l’acqua → frazione purificata.

Per la separazione a pH neutro, utilizzo sostanze che portano carica positiva in modo da neutralizzare eventuali cariche

negative.

PEPTIDI CARICHI NEGATIVAMENTE E OLIGONUCLEOTIDI:

• +

Triethylamine (TEA): -N (C H )

2 5 3

EFFETTI DEGLI AGENTI:

1. Met-Enkephalin.

2. ACTH (1-24).

3. a-MSH.

4. ACTH (1-39).

5. Somatostatin.

6. Bovine insulin.

7. Human calcitonin.

EFFETTI DEL pH:

RESOURCE RPC

I più comuni eluenti sono utili per i peptidi sintetici:

SAMPLE: Crude synthetic peptide.

COLUMN: Sephasilâ C8 prep grade 4x250 mm.

ELUENT A: 0.065% TFA in water.

ELUENT B: 0.050% TFA 84% acetonitrile.

… e per campioni più complessi:

SAMPLE: Tryptic digest of ovalbumin.

COLUMN: Sephasil Peptide C18 5 μm 4.6/250.

ELUENT A: 0.065% TFA in water.

ELUENT B: 0.050% TFA 84% acetonitrile.

Rappresentazione grafica di un tipico esperimento di RP-HPLC:

a. EQUILIBRAZIONE CON TAMPONE A.

b. APPLICAZIONE DEL CAMPIONE ED ELUIZIONE DEL MATERIALE NON TRATTENUTO DALLA COLONNA:

volume vuoto.

c. INIZIO DEL GRADIENTE.

d. LAVAGGIO DELLA COLONNA.

e. ELUIZIONE IN ORDINE CRESCENTE DI IDROFOBICITA’.

HPLC

Solventi degassati per rimuovere bolle d’aria.

Miscelatore solventi a determinata concentrazione.

Pre-colonna: di guardia per preservare la colonna dall’usura, trattiene eventuali materiali che non hanno solubilità ideale.

CARICAMENTO MANUALE DEL CAMPIONE

Valvola reodine prima della colonna.

Presenta:

• MANOPOLINA che può essere in posizione di caricamento (campione) o iniezione (campione in colonna).

• SERPENTINA VOLUMETRICA di acciaio a volume definito (quanto campione entra nella colonna (se carico volume

maggiore, è sprecato)).

• CARICAMENTO: campione entra nella serpentina, l’eccesso nel waste.

Si utilizzano siringhe ad alta precisione, tarate, prive di volume morto con ago (?).

• INIEZIONE: gli eluenti spinti dalla pompa sono in connessione con la serpentina e spingono il campione fuori dal

loop, verso la colonna.

ELUIZIONE

• ISOCRATICA: Le condizioni cromatografiche sono mantenute costanti per tutta la durata dell’eluizione.

Es. lavoro solo con buffer A, o unico tipo di eluente.

• GRADIENTE: Graduale aumento del potere eluente.

Cambio anche le concentrazioni, i sali.

La separazione tra i picchi dipende dalla PENDENZA del GRADIENTE:

Sistema assi con tempo eluizione e % solvente B che entra in colonna.

CREAZIONE GRADIENTE IDEALE:

 Fase di equilibrazione: % B inizi