Analisi biochimica

Analitica biochimica UniPD

Programma

• Purificare una proteina da fonti biologiche.
• Metodi di estrazione da cellule.
• Metodi cromatografici.
• Criterio di purezza.

Purificazione di una proteina

Definire obbiettivi e strategia, tenendo conto di:

• Quantità e purezza sufficiente: μg per analisi allo spettro di massa (sensibile), mg per somministrazione.
• Definire un criterio di purezza (omogeneità) in base all'uso del prodotto che si sta purificando.
• Stabilire quali contaminati devono essere per forza rimossi e quali invece possono essere conservati.
• Mantenimento dell'attività biologica.
• Costi e tempi.

Caratteristiche amminoacidi e proteine

Amminoacidi basici: proteina con molti residui basici, in ambiente acido si comporta come un catione.

Punto isoelettrico: proprietà elettriche → cromatografia, comportamento elettroforetico.

Amminoacidi acidi: in ambiente acido sono deprotonati.

Asparagina, legame ammidico.

Amminoacidi con funzione ossidrilica: idrofilici → molecola facilmente scioglibile in buffer.

Amminoacidi idrofobici: molecole altamente idrofobiche.

Amminoacidi aromatici: conferiscono proprietà spettrali (assorbimento luce, fluorescenza intrinseca).

Metionina presenta S-CH₃ ossidabile facilmente all'aria → modifiche proteina critiche per struttura, stabilità, metabolismo, tossicità e manipolazione.

Cisteina forma ponte disolfuro → collega porzioni lontane, contribuisce al folding e alla stabilità, dipende dall'ambiente.

Re-shuffling scombina topologia ponti disolfuro per errato pH, ambiente denaturante o riducente.

Livelli di purezza richiesti

• Estremamente alti (> 99%):
  • Terapia.
  • Studi in vivo: molecole in copresenza possono variare l'attività della proteina.
• Alti (95-99%):
  • Cristallizzazione per analisi ai raggi X.
  • Metodi per la caratterizzazione chimico-fisica.
• Medi (<95%):
  • Sequenziamento N-terminale.
  • Antigeni per la produzione di anticorpi monoclonali.

Strategie

• Saggio rapido e riproducibile per proteina target: es. determinare se la proteina sta nel surnatante o nel pellet dopo centrifugazione.
• Test enzimatici: kit, reazioni in provetta, caratteristici. Specifico, sensibile, poco costoso.
• Immunoblotting (Western blot): con anticorpo specifico + immunorivelazione. Specifico, sensibile, richiede l'anticorpo.
• Elettroforesi: se conosco peso molecolare.
  • SDS-PAGE: Non specifico, poco sensibile.
• Marcatura radioattiva o fluorescente: fosfoproteina fatta produrre da coltura in presenza di P → marcatura + autoradiografia. Molto sensibile, richiede un ligando.

Per determinare le condizioni di purificazione di una proteina è fondamentale sviluppare un test rapido per seguire la presenza della proteina nei vari passaggi di purificazione. L'assenza di un test rapido obbligherà a fare elettroforesi o dosaggi immunoenzimatici con notevole perdita di tempo. Per gli enzimi si sceglieranno test rapidi basati sulla reazione catalizzata, con osservazione “occhiometrica” o spettrofotometrica della reazione. Per proteine prive di attività enzimatica si potranno scegliere reazioni specifiche verso alcuni gruppi presenti nella proteina (es gruppi prostetici). In genere il campione sottoposto a test non si recupera, quindi occorre che il test venga fatto con piccole quantità di campione.

Determinazione grado di purezza

• Metodi elettroforetici:
  • SDS-PAGE: condizioni denaturanti → tutte proteine con la stessa carica → migrazione secondo il peso molecolare.
  • Campione 1 (estratto crudo). Campione 2 → 6. Campione 7 (standard contenente varie proteine a peso molecolare definito).
  • Le varie fasi di purificazione devono portare ad un miglioramento, altrimenti cancello la determinata fase che peggiora la situazione.
  • IEF
• Determinazione contenuto proteico totale:
  • Metodi colorimetrici: per analisi quantitativa delle proteine totali in soluzione. Viene prodotto un complesso con caratteristiche spettrali specifiche. Necessario creare una retta di taratura.
    • Biureto.
    • Lowry.
    • Bradford.
    • Acido biocinconico.
  • Assorbanza UV: per proteine abbastanza purificate o purificate. Cromatografia (tecnica eccellente, varie applicazioni, purificare e caratterizzare).

Protocolli di purificazione – Proprietà della proteina target

Proprietà della proteina

Stabilità parametri:

• pH → Condizioni per IEX (anche AC and RPC)
• Forza ionica → Condizioni per HIC
• Co-fattori → Selezione di tamponi, pH, sali, additivi
• Detergenti → Composizione dei tamponi
• Solventi organici → Condizioni per RPC
• Altro (luce, ossigeno, ecc.) → Varie

Proprietà chimico-fisiche

Stabilità parametri:

• Carica (punto isoelettrico) → Selezione delle condizioni per IEX
• Peso molecolare → Selezione della resina per GF
• Modificazione post-traduzionali → Selezione delle condizioni per AC
• Affinità biospecifica → Selezione dei ligandi per AC
• Resa nei processi di purificazione multi-step

Strategia a 3 fasi

• Purificazione iniziale della molecola di interesse dall'estratto crudo:
  • Tende a sgrezzare il materiale iniziale (isolamento veloce dall'estratto crudo).
  • Eliminazione di sostanze che interferiscono con le analisi successive, es. per cromatografia necessario rimuovere parti solide e contaminanti.
  • Riduzione di volumi e concentrazione, rende le condizioni ideali di solubilizzazione. Limitato grado di risoluzione. Tecniche cromatografiche consigliate: IEX, AC, HIC.
• Purificazione intermedia:
  • Isolamento della proteina di interesse dalle altre, da acidi nucleici, endotossine, virus, ecc.
  • Rimuove le impurezze. Importante rimozione anche degli allergeni (spesso sono proteine contenenti mutazioni).
  • Le tecniche usate devono avere un elevato potere risolutivo e possono essere complementari a quelle usate nella fase I (es. un gradiente a step nella eluizione, un metodo di desorbimento più selettivo).
• Purificazione finale:
  • Rimozione finale dei contaminanti, aggiustamento del pH, sali e condizioni per lo storage del campione.
  • Raggiungimento del grado di purezza prescelto/richiesto. Il parametro risoluzione è il più discriminante nella scelta del metodo di purificazione. Il grado di purezza raggiunto in una fase non può essere perso nelle fasi successive.

Un approccio di purificazione sistematico - Alcune regole generali

• Mettere a punto un saggio.
• Fissare gli obiettivi (purezza e quantità).
• Caratterizzare la proteina target: anche utilizzando la letteratura (possono non essere le stesse proteine e avere alcune caratteristiche diverse).
• Usare principi di separazione differenti: carica proteina, punto isoelettrico.
• Usare pochi passaggi.
• Limitare la manipolazione del campione tra gli steps di purificazione: provette non perfettamente pulite, polvere.
• Iniziare con alta selettività e poi aumentare efficienza.
• Rimuovere le proteasi velocemente: tagliano velocemente la proteina di interesse.
• Utilizzare o ottenere volumi piccoli di soluzione: facile manipolazione, no diluizione.
• Scegliere sempre la via più facile ed a minor costo.

Estrazione

Punto di partenza

• Identificare la fonte biologica (cellula, tessuto, organo).
• Riconoscimento target e separazione.

Il passo iniziale di qualsiasi procedura di purificazione deve essere la distruzione del tessuto di partenza, per rilasciare le proteine contenute nelle cellule.

1. Omogeneizzazione del materiale biologico, con distruzione delle cellule. L'estrazione di proteine extracellulari (es. sangue) non richiede una omogeneizzazione preliminare, è già fluido.
2. Separazione dei diversi compartimenti cellulari, sulla base della massa: centrifugazioni successive, con separazione del surnatante e impostazione di diversi giri/tempi.
3. Eventuale solubilizzazione con detergenti.

Omogeneizzazione

Scelta tampone adatto (molto importante perché determina il campione), secondo:

• Forza ionica (concentrazione sali, caratterizza la cellula, osmolarità): importante per interazioni amminoacidi carichi delle proteine.
  • Troppo alta → possibile induzione fenomeni precipitazione proteine (salting out).
  • Troppo bassa → interazioni sbagliate.
• pH: dipende dalla carica della proteina target, ideale per la sua purificazione, generalmente intorno pH neutro.
  • Proteina istonica a pH 2 (?), proteina pepsina anche, proteine del sangue pH neutro.
• Antiossidanti (DTT, β-mercaptoetanolo, cys, glutatione). Es. se voglio proteina con ponti disolfuro aperti (cisteina): se voglio i ponti disolfuro chiusi (proteina ossidata) devo fare attenzione all'assenza di fattori ossidanti.
• Inibitori di enzimi: Es. inibitori proteasi (tripsina, chimotripsina (TPCK), pepsina (pepstatina)). Es. voler analizzare contenuto proteico in stato di gravidanza (durata diversa in diversi organismi), correlazione quantità e tipo proteine durante le fasi, bisogna impedire che avvengano reazioni collaterali.
• Substrati enzimatici e cofattori: metallo proteina (agenti chelanti).
• EDTA (etilendiamminotetra-acetato).
• PVP (polivinilpirrolidone): assorbe composti fenolici altamente ossidanti → solfoni.
• Sodio azide: antibatterico, per evitare contaminazioni a causa di condizioni favorevoli alla crescita.

Condizioni estrazione

• A freddo: se possibile, rallentamento reazioni enzimatiche.
• Sotto azoto: per ridurre l'ossigeno in soluzione, impedisce scambio con ossigeno (ossidazione amminoacidi e SH cisteine), insufflazione gas in piccoli reattori o su superficie libera del buffer.
• Richiesto tampone: con bassa forza ionica, pH neutro, inibitori di proteasi ed EDTA.
• Detergente: per proteine in membrana (problema critico), deve essere non ionico (non formano micelle) e non denaturante; un buffer salino non riuscirebbe ad estrarle, necessario detergente.
  • SDS no, perché difficilmente separabile dalle proteine (induce strutture ad α-elica in proteine che non ce l'hanno).
• Antiossidante (DTT, β-ME): per proteine facilmente ossidabili.
• Glicerolo: per proteine poco stabili, ruolo stabilizzante, pellicola protettiva, fino a 50% → fluido, sospensione, attenzione alla manipolazione, ma idrosolubile.

Metodi

Dipendono dal tipo di cellule presenti nel campione iniziale (caratteristiche particolari come membrana, parete).

• Mammiferi: diametro 10 mm, con membrana, facili da distruggere.
• Vegetali: diametro 100 mm, con parete cellulare rigida, costituita da carboidrati, cere e lignina.
• Batteri: diametro 1-4 mm, con membrana, strato spesso di peptidoglicani nei Gram +, strato di lipopolisaccaridi nei Gram -.
• Funghi e lieviti: parete cellulare rigida, composta da polisaccaridi.

Comuni metodi di estrazione e distruzione delle cellule

Blandi

• Shock osmotico: tramite manipolazione della forza ionica, condizioni esterne alla cellula diverse da quelle interne, disequilibrio. Es. Un abbassamento drastico della pressione osmotica esterna (immersione in acqua distillata) provoca un rigonfiamento delle cellule ed una ‘esplosione’ delle membrane, riversando all’esterno il contenuto proteico. Non funziona con cellule aventi parete.
• Digestione enzimatica: Utilizzo enzimi che distruggono la parete cellulare. Molto usati lisozimi: rimuovono la parete dei peptidoglicani dei batteri Gram+.
• Dopo digestione della parete cellulare, la membrana si rompe per effetto osmotico del tampone.
• Omogeneizzatori manuali (frullatori, omogeneizzatori a pestello): Adatti per cellule animali e tessuti vegetali, non va bene per cellule di microorganismi. Trattamento con azoto liquido → congelamento, per facilitare la rottura con pestello. Fino ad ottenere un composto che sembra avere le stesse caratteristiche in tutti i suoi punti (colore, consistenza, lavorabilità).
• Macinazione e triturazione.

Vigorosi

• Ultrasonicazione: Onde sonore ad alta frequenza (>20 kHz) per 30-60 sec. Si ha rottura per frammentazione e cavitazione. Utilizzo per cellula in coltura e microbi. Sviluppa calore → stimolazione reazioni enzimatiche e metaboliche e degradazione termica delle proteine.
• Omogeneizzatori ad alta pressione (Manton – Gaulin): La sospensione di cellule è inserita in una camera di compressione di acciaio inox, dotata di pistone e chiusa da una valvola a spillo. Si rimuove tutta l'aria dalla camera (così che rimanga solo la sospensione di cellule) e mediante il pistone vengono applicate sulle cellule pressioni idrauliche elevatissime (fino a 100 kP). Le cellule subiscono una compressione notevole. Poi si apre lentamente la valvola a spillo, così che le cellule possono fuoriuscire dalla valvola stessa. A causa del brusco sbalzo di pressione cui sono sottoposte uscendo dalla valvola, le cellule ‘esplodono’ e si frantumano.
• French press.
• Precipitazione frazionata: procedura molto utilizzata. Diverse sostanza utilizzabili, di solito solfato di ammonio, soluzioni ad elevate concentrazioni o sature. Salting out con (NH₄)₂SO₄ per precipitare le proteine. Il solfato d'ammonio sottrae le molecole di acqua che fungevano da molecole solvatanti e fa precipitare le proteine, prima quelle più idrofobiche, poi quelle più idrofile e solubili (aggiunta di un'aliquota per volta, a titolo noto). Continuo fino a lasciare in soluzione quelle che mi interessano. Secondo la teoria di Debye-Huckel, gli ioni di sale aggiunto competono con gli ioni presenti nella soluzione per le molecole di solvente, facilitando l'aggregazione proteica. Fino ad una certa concentrazione di sale, la solubilità di una proteina aumenta (salting in). Se la concentrazione del sale aumenta, l'acqua viene sequestrata per idratare i controioni e i macroioni precipitano (salting out). È anche possibile precipitare proteine con il pH o temperatura. Le proteine precipitate in questo modo in genere sono denaturate e non sono più recuperabili allo stato nativo.

[Domanda: come si realizza il de-saulting (rimozione sali dalla soluzione proteica): dialisi, colonne cromatografiche].

Centrifugazione

Sfrutta la forza generata da una centrifuga per separare i componenti aventi densità diversa di una sospensione.

Applicazioni

Purificazione di complessi macromolecolari, micelle, cellule e grosse strutture cellulari, materiale extracellulare, ecc., in base alla diversa densità di questi rispetto al mezzo in cui sono sospesi o dispersi (velocità di sedimentazione).

Il materiale da centrifugare è posto in tubi alloggiati nel rotore di una centrifuga. Il rotore viene fatto girare a velocità elevata (fino a 100.000 giri al min.) per un certo tempo, sottoponendo così la sospensione a forze centrifughe pari a molte migliaia di volte la forza di gravità, che causano la sedimentazione delle particelle che presentano anche minime differenze di densità.