Analisi farmaceutica 3

CROMATOGRAFIA DIRETTA (NORMALE

FASE contropressione molto bassa

Quindi, non avendo ne pori e ne particelle, ha una

IN ciano CN, dioli OH, ammino NH2

La silice viene derivatizza con gruppi polari, come ad esempio gruppi gruppi molto viscosi

Infatti viene utilizzata per campioni così da poter impostare dei flussi molto elevati (come ad

La silice derivatizzati con gruppi ammino non può essere utilizzata con aldeide e chetoni perché reagisce portando all’immina esempio 9 mL/min) avendo ha contropressione così bassa

mesopori macropori

Si ha comunque dei pori chiamati e che conferisco alla colonna una elevata permeabilità

La fase stazionaria è polare al passaggio della fase mobile

La fase mobile è apolare

CROMATOGRAFIA SCAMBIO IONICO

A

CROMATOGRAFIA Hydrophilic Interaction Chromatography

HILIC

per campioni poco solubili in fase mobili molto acquose per campioni molto polari

È utilizzata o che verrebbero

diluiti troppo velocemente in fase inversa

fase

È un tipo di cromatografia in normale (diretta) ma ha una fase mobile che è più simile alla fase inversa

fase mobile poca H2O acetonitrile

Ha una costituita da acqua e una porzione prevalente di CH3CN

Gli analiti vengono eluiti in ordine crescente di idrofilia, quindi dal meno idrofilo al più idrofilo, essendo in fase normale

Viene molto utilizzata per l’analisi di peptidi, proteine, acidi nucleici, quindi per analiti polari

Infatti la fase normale viene utilizzata per analiti polari

meccanismo di ripartizione

Il meccanismo può essere sia un come nella estrazione liquido/liquido fra la

porzione di acetonitrile della fase mobile e l’acqua che idrata la fase stazionaria

meccanismo di adsorbimento

Oppure può essere un come nella cromatografia in fase diretta

Le fasi stazionarie delle HILIC sono molto simili alle fase stazionare della fase diretta

Se lo stesso campione viene analizzato sia in fase inversa e sia in fase HILIC, si ha un inversione della

selettività = cioè ciò che eluiva per primo poi eluisce per ultimo

Il vantaggio di usare la cromatografia HILIC rispetto a una fase normale è che qui si usano solventi meno tossici Proprietà ideali delle varie CSPs:

Campo di applicazione vasto

• —> cioè che quando si compra una colonna cromatografica di un tipo, si spera che con quel tipo di colonna si riesca a

FASI CHIRALI

STAZIONARIE separare gli enantiomeri di sostanze con caratteristiche chimico-fisiche diverse da loro, quindi che sia una colonna con alta versatilità

• Robustezza e Stabilità (lifetime della colonna)

*Per semplificazione parleremo di farmaci dotati di un solo centrostereogenico* Elevato valore di enatioselettività

• —> è importante avere alta enantioselettività perché se si deve valutare la presenza di impurezze, bisogna avere un

quindi in miscela si avrà due enantiomeri cromatogramma con due picchi per distinti

Ampia compatibilità con le fasi mobili

• —> il campione di partenza può essere molto acquoso, come ad esempio il plasma, e quindi la sua fase mobile

Importanza della chiralità in campo farmaceutico sarà polare e bisognerà usare una cromatografia in fase inversa e anche chirale

Talidomide

Ci sono alcuni farmaci, come la (antiemetico), che • Load elevato —> quindi che non si sovraccarichino subito con poca quantità di campione

portano tossicità solo uno dei due enantiomeri Tempi di analisi ridotti

•

Warfarin

Un altro esempio è il (anticoagulante) che, in base al • Possibilità di inversione dell’ordine di eluizione —> ci sono certe fasi stazionarie che, cambiando la temperatura o la composizione della fase mobile,

enantiomero, si ha differenze di potenza portano a un inversione di eluizione quindi non separano più R-S ma S-R

Limonene

Il ha due odori diversi • Facilità di predizione del meccanismo di ricognizione

Si ha queste differenze enantiomeri che perché l’enantiomero, nel nostro organismo, va a interagire

ambiente chirale

con proteine/enzimi che sono anch’essi chirali, quindi si trova ad agire in un CICLODESTRINE

Perché bisogna mettere a punto un metodo enatioselettivo? Scopo: ciclodestrine

Le sono dei oligomeri che sono costituite da unità di piranosio (zucchero), e

purezza di composti omochirali

• Per determinare la —> quindi c’è bisogno di una toroide

quindi sono delle strutture chirali e hanno una struttura tridimensionale a forma di

MAU1

tecnica che sia capace di distinguere, e quindi di separare, due enantiomeri La cavità è apolare e l’esterno è polare

R S più comuni

test di stabilità delle forme farmaceutiche

• Per il —> può capire che le condizione la

>

In base al numero di unità di piranosio presenti (6, 7, 8), si distinguono α β γ ciclodestrine

esterna (luce, temperatura) possa andare a incidere sulla stabilità del prodotto e sono direttamente proporzionale alla grandezza dell’apertura della toroide

omochirali e causare la racemizzazione Quindi si sceglie il tipo di ciclodestrine in base alle dimensioni del nostro analita

studi farmacocinetici

• Per —> as esempio, se si vuole monitorare il destino di un > +

principio attivo chirale nel plasma di un paziente, allora si può monitorare il destino

dei due enantiomeri tramite una tecnica enantioselettiva. Ad esempio un

enantiomero può venire metabolizzato e eliminato più velocemente dell’altro

studi tossicologici

• Per —> per condurre studi di tossicità sui singoli enantiomeri,

prima dobbiamo essere in grado di separarli tramite le tecniche enatioselettive

Quali sono le tecniche enatioselettive Queste ciclodestrine vengono derivatizzate sul supporto di silice, quindi la silice viene derivatizzata con le ciclodestrine

Ci sono varie tecniche spettroscopiche cromatografiche che si occupano di distinguere due enantiomeri, e sono:

• La prima messa a punto è stata la gas cromatografia GC chirale Sono fasi stazionarie che lavorano in fase mix-mode, quindi ne in fase diretta e ne in fase inversa

• TLC chirale Comunque la loro fase mobile è piuttosto polare

• Cromatografia in fase supercritica SFC chirale —> si ha colonne con fasi stazionarie chirale e fase mobile supercritica ↑

• Elettroforesi capillare CE chirale L’utilizzo di ciclodestrine pure come derivatizzazione su silice non sono molto utilizzate, infatti si utilizzano maggiormente le

—> si va ad aggiunge al BGE un additivo chirale

• Cromatografia elettrocinetica micellare MECK chirale ciclodestrine derivatizzate chimicamente

a loro volta

• Elettrocromatografia capillare CEC chirale Infatti, questa derivatizzazione chimica sulle ciclodestrine ci permette di aggiungere gruppi chimici che possono andare a

più diffusa cromatografia liquida LC chirale

• Ma la è la instaurare dei legami con enantiomeri di tipo diverso

CROMATOGRAFIA LIQUIDA CHIRALE

La cromatografia liquida chirale si distingue in due categorie in base al tipo di separazione: ETERI A CORONA

Separazione indiretta

• = prima dell’iniezione (quindi fuori dalla colonna cromatografica), si ha la formazione di eteri a corona,

Analogamente alle ciclodestrine, la silice può essere derivatizzati anche con dei cioè dei eteri ciclici

composto enantiomericamente puro con il nostro racemo

diasteroisomeri covalenti che si formano per reazione di un

Quindi si formano due diasteroisomeri che sono composti che hanno caratteristiche chimico-fisiche differenti e quindi Sono dei eteri ciclici che possono essere anche a struttura complessa, cioè con tanti anelli aromatici

possono essere poi iniettati e distinti tramite una colonna achirale Questi anelli aromatici possono instaurare delle interazioni π-π con enantiomeri di racemi

Sono abbastanza utilizzate, sopratutto per gli enantiomeri di sali ammonici quaternari, con i quali formano

Separazione diretta

• = si ha due sotto-gruppi e, in entrambi i casi della separazione diretta, si ha la formazione dei legami a idrogeno

diasteroisomeri transitori

di tramite legami non covalenti direttamente in colonna in un ambiente chirale

Per creare l’ambiente chirale in colonna si possono avere due possibilità: Eteri a corona vs Ciclodestrine:

• si usa una fase mobile chirale e una fase stazionaria achirale (caso meno comune) Anche gli eteri a corona permetto dei legami a inclusione, andando a sfruttare la loro

• si usa una fase mobile achirale e una fase stazionaria chirale CSP (caso più diffuso) <— è quella che vedremo noi struttura ad anello

Nella separazione diretta, non si iniettano i diasteroisomeri ma si inietta direttamente il nostro racemo, perché i diasteroisomeri Però gli eteri a colonna hanno un interno della cavità polare e un esterno apolare

si formeranno in modo dinamico all’interno della colonna cromatografica (cioè l’opposto delle ciclodestrine)

Quindi ciascun enantiomero del racemo instaura con un diasteroisomero, che può essere sulla fase mobile o stazionaria, un

equilibrio transitorio e rapido

Essendo un equilibrio così rapido, al detector si rileva i composti enatiomericamente liberi dai complessi diasteroisomerici (MIPs)

IMPRINTED

MOLECULARY POLYMERS

CSP

stationary phase

(chiral )

Separazione diretta con fase stazionaria chirale del racamo

semara

· Già vista nella preparazione del campione

regola a tre punti di Dalgliesh,

Secondo la un entiomerio deve instaurare con la fase stazionaria In questo caso, come templato si userà uno dei due enantiomeri

chirale almeno un interazione di tre punti per avere un complesso diasteroisomerico con stabilità

maggiore rispetto al complesso diasteroisomerico che si forma tra l’altro enantiomero e la fase

stazionaria che avrà un interazione di due punti più Più COLONNA

LUNGO In

a

Stabile =

>

Quindi si avrà la formazione di due complessi diasteroisomerici con stabilità differente CELLULOSA AMILOSIO

e

Relazione tra enatioselettività α e energia libera ΔΔG: diretta

Sono delle fasi stazionarie molto utilizzate, soprattutto in fase

ΔΔG = -RT ln α

ΔΔG = ΔΔH - T ΔΔS

ΔΔG = differenza in energia libera standard per l’’interazione degli enantiomeri con la fase stazionaria

Più è bassa l’energia libera e più il complesso è stabile Come le ciclodestrine, anche la cellulosa e l’amilosio sono dei materiali di origine naturale

ΔΔH = differenza in entalpia di adsorbimento degli enantiomeri

Δ&Delt