Amminoacidi e Proteine

AMMINOACIDI CARICHI POSITIVAMENTE (BASICI)

AMMINOACIDI CARICHI NEGATIVAMENTE (ACIDI)

Lo stato di ionizzazione di un amminoacido varia con il pH:

a pH acido il gruppo carbossilico non è ionizzato (-COOH) e il gruppo amminico

– 3+

è ionizzato (-NH )

aumentando il pH l'acido carbossilizo è il primo a cedere il protone

– la forma zwitterionica persiste fino a pH 9 quando il gruppo amminico ionizzato

– comincia a cedere il protone

Solo 3 amminoacidi con anello benzenico assorbono nell'UV:

Ci devono essere dei sistemi che mi fanno separare quantitativamente gli amminoacidi

in soluzione: a pH acido gli amminoacidi sono carichi positivamente

a pH basico gli amminoacidi sono carichi negativamente

Si prende in considerazione un amminoacido costituito da una matrice di

POLISTIRENE SOLFORATO.

Se riempiamo una colonna cromatografica a pH acido con una resina, saremo sicuri che

3+

in soluzione tutti gli amminoacidi presenti saranno in forma NH e la resina sarà

salificata per la presenza di ione sodio.

Se si fa variare il pH e la forza ionica (aumentando la concentrazione dello ione sodio)

si può ottenere una eluizione nel tempo di tutti gli amminoacidi separati l'uno

dall'altro.

Via via che passa un certo volume di fluente, gli amminoacidi passano a tempi diversi.

Se si guarda l'ordine con cui questi escono dalla colonna, si capisce qualcosa della loro

struttura:

il primo ad uscire sarà l'acido aspartico perchè è piccolo e con 2 gruppi COOH

– gli amminoacidi basici saranno gli ultimi a distaccarsi perchè rimangono

– fortemente legati alla resina

in questi fenomeni, le molecole si distribuiscono sempre secondo una curva gaussiana.

Al fluido che passa attraverso la colonna, se faccio arrivare una sostanza che colora gli

amminoacidi, ottengo qualcosa di diverso.

Ad esempio con la ninidrina ottengo una soluzione blu-violetta.

I picchi gaussiani che ottengo non sono uguali, l'importante è che l'area di ogni picco

sia proporzionale alla quantità di quell'amminoacido.

Quindi l'analisi va sempre confrontata con il cromatogramma standard.

Calcolando l'area del singolo picco col campione, vedo a quante nanomoli corrisponde

l'area.

Perciò il tempo mi da la qualità e l'area del picco mi da la quantità.

In certi casi servono sistemi di sensibilità maggiore.

Ad esempio si può usare una sostanza che dia un risultato di fluorescenza.

Occorre un sistema di rivelazione che riconosca la fluorescenza.

In tutti i casi il cromatogramma da dei picchi.

Nei fluidi fisiologici il cromatogramma da un'analisi più lunga e complessa e ci sono più

amminoacidi.

Se un sistema non funziona correttamente, si ha un picco troppo elevato in confronto a

tutti gli altri amminoacidi presenti nello stesso siero.

DAL PUNTO DI VISTA CHIMICO GLI AMMINOACIDI SONO TUTTI ACIDI POLIPROTICI

DEBOLI. PROTEINE

Le proteine sono polimeri lineari (non ramificati) formati dall'unione del gruppo α-

carbossilico di un amminoacido e il gruppo α-amminico di un altro amminoacido

attraverso un LEGAME PEPTIDICO, con perdita di una molecola di H O:

2

Quando un certo numero di amminoacido vengono uniti tra loro da legami peptidici si

forma una catena polipeptidica in cui ogni unità amminoacidica viene detta RESIDUO.

Una catena polipeptidica ha una polarità poiché le sue estremità sono differenti: ad una

estremità c'è il gruppo α-amminico, all'altra un gruppo α-carbossilico.

Per convenzione il terminale amminico viene considerato l'inizio della catena

polipeptidica, e quindi la sequenza degli amminoacidi di una sequenza polipeptidica si

scrive a partire dal residuo ammino-terminale.

La maggior parte delle catene polipeptidiche è costituita da un numero di residui

amminoacidici che varia da 50 a 2000.

i peptidi contenenti un numero minore di amminoacidi vengono detti OLIGOPEPTIDI.

FUNZIONI DELLE PROTEINE

Le proteine svolgono un numero svariato di funzioni tra le quali:

Riserva: caseina

Trasporto: emoglobina (rifornisce i tessuti di O )

2

mioglobina (ha funzione di riserva a livello muscolare)

Contrattile: actina e miosina, componenti principali di un muscolo, il quale si contrae

proprio in seguito ad un movimento di scivolamento di questi due

filamenti proteici

Protettiva: anticorpi, indispensabili per la risposta immunitaria dato che riconoscono e

quindi attaccano le sostanze estranee quali batteri, virus ecc

Strutturale: cheratina, collageno, elastina, che hanno funzione di sostegno meccanico

Tossine: batteriche (alcuni batteri secernono delle sostanze proteiche che risultano per

noi tossiche); veleni dei serpenti o degli insetti

Ad azione ormonale: insulina, ormone adrenocorticotropo

IL LEGAME PEPTIDICO

Il legame peptidico, che lega due amminoacidi consecutivi, è essenzialmente planare.

Considerando una coppia di amminoacidi uniti da un legame peptidico, vengono a

trovarsi 6 atomi sullo stesso piano: l'atomo di Cα e il gruppo CO del primo

amminoacido, e il gruppo NH e l'atomo di Cα del secondo amminoacido:

Il legame peptidico ha caratteristiche di doppio legame, che impediscono la rotazione

intorno al legame.

L'impossibilità a ruotare del legame, restringe le possibili conformazioni dello

scheletro covalente e determina la planarità del legame.

La vera struttura del legame peptidico è la risultante di due forme limite di risonanza:

Il carattere di legame doppio è riconoscibile anche per la lunghezza del legame tra il

gruppo CO e il gruppo NH.

Essa è di 1,32Å intermedia tra quella di un singolo legame C-N (1,49Å) e quella di un

doppio legame C=N (1,27Å).

Al contrario, il legame tra l'atomo di Cα e il C carbonilico, e tra l'atomo di Cα e l'atomo

di N del gruppo amminico, sono invece legami singoli puri.

Di conseguenza, due unità peptidiche rigide adiacenti possono avere un certo grado di

libertà di rotazione intorno a questi legami.

Le rotazioni di questi legami sono definite da ANGOLI DIEDRICI:

PHI: angolo di rotazione intorno al legame tra l'N e l'atomo di Cα

PSI: angolo di rotazione intorno al legame tra il Cα e l'atomo di C carbonilico

Gli angoli PHI e PSI determinano l'andamento della catena polipeptidica.

Però non tutte le combinazioni sono possibili.

RAMACHANDRAN ha osservato che molte combinazioni sono impedite a causa di

interferenze sferiche tra gli atomi.

I valori permessi possono essere individuati attraverso un grafico bidimensionale

detto GRAFICO DI RAMACHANDRAN.

¾ delle possibili combinazioni tra i due angoli vengono escluse da ingombro sterico.

I valori che stanno sulla diagonale centrale portano alla formazione di una struttura a

pieghe (n=2) e sono stabili.

A destra della diagonale si hanno tutte le strutture elicoidali levogire perchè n è

negativo, mentre a sinistra sono destrogire (n positivo).

Mano a mano che ci si allontana dalla diagonale aumentano le spire.

Le eliche levogire del collagene e della poliprolina, che hanno 3 residui per spira,

cadono in zone ad alta stabilità, mentre l'α-elica levogira cade in una zona con stabilità

intermedia.

Si possono trovare dei parametri in base ai quali si può descrivere la struttura:

n è il numero di unità per giro di elica

d è l'innalzamento sull'asse per ogni residuo

p è il passo dell'elica e corrisponde al prodotto tra n e d

Se la rotazione è destrorientata n è positivo.

Se è sinistrorientata n è negativo.

Se n=2 si ha una situazione a zig-zag.

CLASSIFICAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine possono essere classificate in:

Fibrose: tendono ad avere strutture lineari relativamente semplici e regolari.

Hanno strutture solide, in cui è prevalente un unico elemento di struttura

secondaria (solo α-elica in cui più strutture si legano l'una all'altra con il

metodo testa-coda).

Sono tipicamente insolubili in H O.

2

Devono resistere a urti, tensioni, lavori meccanici.

Esempio: collagene.

Globulari: sono di forma quasi sferica.

La catena polipeptidica si ripiega in maniera compatta in modo che le

catene laterali degli amminoacidi idrofobici vengono a trovarsi all'interno

della molecola e le catene laterali degli amminoacidi idrofilici siano

all'esterno, esposte al solvente (H O), quindi sono solubili in soluzioni

2

acquose.

Esempio: mioglobina.

STRUTTURE DELLE PROTEINE

Struttura primaria

La struttura primaria è la semplice sequenza amminoacidica ed è data dal numero e

dal tipo di amminoacidi che si susseguono nella catena.

Tale struttura non è funzionalmente attiva.

Struttura secondaria α -elica

Tale struttura è data da una catena polipeptidica strettamente avvolta, le cui catene

laterali si estendono verso l'esterno con un andamento a spirale.

L'α-elica è stabilizzata da legami idrogeno che si formano tra il gruppo CO di un

amminoacido e il gruppo NH dell'amminoacido che si trova 4 residui più avanti nella

sequenza lineare.

Nell'α-elica ci sono 3,6 residui di amminoacidi per ogni giro dell'elica ed ha un passo di

5,4Å quindi: n=3,6 e p= 5,4Å.

Il senso di avvitamento di un'elica può essere:

Destrogiro (orario)

Levogiro (anti-orario)

Entrambi gli avvitamenti sono possibili, tuttavia l'elica destrogira è molto più favorita

dal punto di vista energetico poiché presenta meno impedimenti sterici tra le catene

laterali e la catena principale.

Tutte le α-eliche trovate nelle proteine sono destrogire.

I legami ad idrogeno che si formano hanno una direzione pressochè parallela all'asse

dell'elica quindi è una struttura estremamente stabile perchè forma il numero

massimo di legami idrogeno tra Co e NH.

Le catene laterali non devono avere cariche, non devono essere ingombranti e non

devono formare nuovi legami.

I residui eventualmente presenti possono disturbare la formazione della struttura ad

elica.

La prolina interrompe l' α-elica perchè ha un gruppo NH anziché NH , percui quando si

2

forma il legame peptidico rimane senza un H e il carbonio in α e l'azoto partecipano

alla formazione di un anello che limita la rotazione e crea problemi di ingombro

sterico.

Solo alcune proteine fibrose, come le α-cheratine, hanno strutture ad α-elica.

Le proteine globulari hanno zone ad α-elica e zone con strutture a pieghe.

I punti di interruzione fanno parte della struttura e contribuiscono ad un certo tipo di

ripiegamento.<