Sequenziamento del DNA
Lo sviluppo di genoteche di DNA rese possibile, almeno in teoria, il sequenziamento completo del DNA. Inizialmente il sequenziamento del DNA era lento e laborioso e i risultati erano limitati. Il sequenziamento permette di ricostruire l’ordine delle basi che compongono il DNA di nostro interesse, ed inoltre la funzione di un gene si può dedurre dalla sua sequenza, per esempio, confrontandola con quella di geni le cui funzioni siano già note.
Il substrato per il sequenziamento del DNA è spesso un DNA ricombinante che deve essere denaturato in modo da consentire, per dirigere la sintesi della nuova elica, l’uso di primer a singola elica con complementarietà specifica per l’elica stampo. Secondo un metodo sempre più diffuso si usa, invece, il DNA prodotto per amplificazione di PCR, lo si converte nella forma a singola elica e lo si utilizza come stampo per il sequenziamento. Il prodotto finale dei vari metodi è una popolazione di molte copie identiche del DNA che si vuole sequenziare.
Metodo di Sanger
Il metodo di sequenziamento del DNA che fu usato per sequenziare il genoma umano e molti altri genomi era il metodo di sequenziamento enzimatico inventato da Fred Sanger a metà degli anni ’70. Il metodo si basa sull’inibizione casuale dell’allungamento della catena, creando eliche di DNA di nuova sintesi di varie dimensioni, che possono essere separate sulla base della loro lunghezza.
Il DNA, per fungere da stampo per la sintesi in vitro di una nuova elica di DNA complementare mediante un’appropriata DNA polimerasi, deve essere a singola elica. Il principio della tecnica sviluppata da Frederick Sanger si basa sull’utilizzo di nucleotidi modificati (presentano lo zucchero desossiribosio privo del gruppo ossidrilico OH in posizione 3’) per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche. Questi nucleotidi prendono il nome di dideossinucleotiditrifosfati (ddNTPs).
Il protocollo classico richiede un templato di DNA a singolo filamento, un primer per iniziare la reazione di polimerizzazione, una DNA polimerasi, deossinucleotidi e dideossinucleotidi per terminare la reazione di polimerizzazione. I nucleotidi modificati (ddNTPs) devono essere marcati (radioattivamente o per fluorescenza). Il campione di DNA da sequenziare viene diviso in quattro reazioni separate, ognuna delle quali contiene la DNA polimerasi e tutti e 4 i deossiribonucleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Ad ognuna di queste reazioni viene poi aggiunto solo uno dei quattro nucleotidi dideossi (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) in quantità stechiometricamente inferiore per permettere una elongazione del filamento sufficiente per l'analisi. L'incorporazione di un dideossinucleotide lungo il filamento di DNA in estensione ne causa la terminazione prima del raggiungimento della fine della sequenza di DNA stampo; questo dà origine ad una serie di frammenti di DNA di lunghezza diversa interrotti in corrispondenza dell'incorporazione del dideossinucleotide, che avviene casualmente.
I frammenti generati da queste reazioni vengono poi fatti correre su gel di poliacrilammide-urea che permette la separazione dei vari frammenti con una risoluzione di un nucleotide, cioè i frammenti si separano in base alla differente lunghezza ed anche se differiscono di un solo nucleotide. Ognuna delle 4 reazioni è corsa su pozzetti vicini, dopodiché le bande sono visualizzate su lastra autoradiografica (come quella dei raggi), e la sequenza viene letta direttamente sulla lastra.
La sequenza viene letta dal basso della lastra verso l’alto. Considerando una lastra schematizzata, come quella riportata di seguito, notiamo che nella prima corsia (A), si osservano 3 bande e
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