9. Sequenziamento del dna: metodo di sanger e ngs (454 genome sequencer flx instrument)

SFERAFASE 2: PCR IN EMULSIONE (emPCR)

La prima fase è seguita da una PCR in emulsione. Le sfere, ciascuna legata a un determinato frammento di DNA, vengono inserite all'interno di un'unica provetta. Questo tipo di PCR, quindi, permette di amplificare all'interno della stessa provetta in maniera fisicamente separata una grande quantità di frammenti di DNA.

L'emulsione viene creata mescolando la mix di PCR (polimerasi, primer, deosinnucleotidi, MgCl) con olio minerale. Si creano così delle micelle di mix di PCR in emulsione nell'olio. Le micelle sono degli aggregati di molecole anfifiliche, cioè molecole dotate di una coda idrofoba e una testa idrofila. Queste molecole, per formare una micella, si dispongono con le teste verso l'esterno e le code verso l'interno.

In questo caso, al centro di ogni micella è contenuta una biglia. È proprio all'interno di questa micella che avviene l'amplificazione del DNA.

frammento di DNA legato alla biglia. Di conseguenza, ogni biglia, dopo l'amplificazione del frammento, presenterà milioni di frammenti adesi ad essa. FASE 3: IL PIROSEQUENZIAMENTO Successivamente le sfere, sulla cui superficie sono presenti le varie copie di un determinato frammento, vengono deposte in una piastra Pico Titer costituita da circa 1,6 milioni di pozzetti, che hanno un diametro tale da poter accomodare un'unica biglia. A questo punto vengono aggiunte la DNA polimerasi ed altre sferette di dimensioni minori, a cui sono legati covalentemente gli enzimi responsabili della reazione di pirosequenziamento. In tal modo, centinaia di migliaia di biglie, ciascuna recante milioni di copie del singolo frammento legato, vengono sequenziate in parallelo. A questo punto, la piastra così preparata viene inserita nel dispositivo Roche 454, di fronte ad una fotocamera ad alta risoluzione (chiamata CCD camera). La piastra viene inserita qui. Questa è la camera CCD. Prima diprocedere con la descrizione degli step del pirosequenziamento che avvengono all'interno di questa macchina, è bene dire che gli elementi necessari al pirosequenziamento, e che sono legati alle sferette che vengono aggiunte successivamente alle biglie nella piastra Pico Titer, sono gli enzimi DNA polimerasi, ATP solforilasi, luciferasi, e apirasi, i substrati dNTP, adenosin 5' fosfosolfato (APS) e luciferina e i primer. Quindi il pirosequenziamento vero e proprio inizia con il legame tra l'estremità libera (cioè non legata alla biglia) di un frammento e un primer. Questo avviene in ogni pozzetto. Facciamo, però, riferimento agli eventi che si susseguono in un solo pozzetto. Avvenuto, quindi, il legame tra primer e frammento, inizia la sintesi del filamento complementare a quello del frammento legato alla biglia. Immaginiamo di avere una sequenza come quella riportata di seguito: Nel pozzetto in cui è contenuta la biglia avviene un flusso dicaso, il flusso di dNTP inizia con la timina, seguita dall'adenina, la citosina e infine la guanina. La prima base del filamento è un'adenina, seguita da una citosina. Quando le timine vengono rilasciate, solo una di esse si lega alla prima base del filamento, mentre le altre vengono degradate dall'enzima apirasi. Quando un dNTP, in questo caso il deossiTimidina trifosfato, si lega a una base per allungare il filamento nascente, si libera un pirofosfato inorganico (PPi). In presenza di adenosina 5'fosfosolfato, l'ATP solforilasi converte il PPi in ATP. L'ATP reagisce con la luciferina per formare Luciferil-AMP, che a sua volta reagisce con l'ossigeno, scindendosi per formare AMP, anidride carbonica e ossiluciferina. Quest'ultima, decadendo da uno stato eccitato, produce la ben nota luminescenza giallo-verde. L'intensità della luminosità dipende dal numero di dNTP aggiunti. In questo caso,caso viene aggiunta solo una timina che corrisponde a una determinata intensità della luminosità. La camera CCD del sequenziatore riesce a capire il tipo di base aggiunta e il numero in base proprio all’intensità luminosa. Quindi la macchina registra che, in un determinato pozzetto