4 DNA Ricombinante:enzimi di restrizione, vettori di clonaggio (plasmidi, cosmidi, cromosomi bac, lieviti, batteriofago lambda)

Tecnologia del DNA ricombinante

Con il termine di DNA ricombinante si indica una sequenza di DNA ottenuta artificialmente dalla combinazione di materiale genetico proveniente da organismi diversi tra loro. Un esempio di DNA ricombinante è un plasmide (cioè una molecola di DNA batterico di forma circolare) che contiene un gene non appartenente al batterio stesso. Il DNA ricombinante è utilizzato per produrre OGM in grado, ad esempio, di funzionare come bioreattori per la produzione di ormoni ad uso medico, come l'insulina, l'ormone della crescita o l'ossitocina, o di vaccini.

Il DNA ricombinante si ricava attraverso la tecnica del clonaggio del DNA: una sequenza di DNA di un dato organismo viene combinata con una molecola di DNA di un altro organismo, ad esempio un plasmide; la molecola risultante viene inserita in una cellula ospite, ad esempio un batterio, dove questa sequenza genica si replica e si ottengono quindi tante copie identiche di quel gene (si parla, appunto, di cloni).

Processo di clonaggio del DNA

• Identificare il gene esogeno che si vuole inserire in un’altra molecola di DNA;
• Tagliare il gene esogeno e isolarlo dal genoma di origine;
• Unire il gene esogeno a una molecola di DNA appartenente a un altro organismo;
• Trasferire tutta la molecola ottenuta all’interno di una cellula ricevente.

Il primo passaggio consiste sempre nel tagliare il DNA: bisogna, infatti, tagliare sia il gene esogeno che la molecola di DNA ricevente. In quest’ultimo caso il taglio serve a creare lo spazio per accogliere il gene proveniente da un altro organismo. Per tagliare e ricucire i geni sono necessari enzimi specifici, quali enzimi di restrizione e ligasi.

Enzimi di restrizione

Alla fine degli anni sessanta del Novecento si scoprì che alcuni batteri si difendono dall’attacco dei virus producendo particolari enzimi, denominati enzimi di restrizione, che tagliano il DNA estraneo riducendolo in frammenti più piccoli, non infettanti. In un processo chiamato digestione da restrizione, questi enzimi spezzano l’ossatura del DNA rompendo i legami tra il gruppo ossidrile all’estremità 3’ di un nucleotide e il gruppo fosfato all’estremità 5’ del nucleotide successivo. Esistono numerosi enzimi di restrizione, ciascuno dei quali taglia il DNA a livello di una specifica sequenza di basi (normalmente 4 o 6), definita sequenza di riconoscimento (o sito di restrizione).

I siti di restrizione sono sequenze palindrome, cioè sia se letti partendo da destra su un filamento e da sinistra sull’altro risultano essere sempre la stessa sequenza:

Gli enzimi di restrizione vengono distinti in enzimi di restrizione del I tipo ed enzimi di restrizione del II tipo. La prima tipologia di enzimi di restrizione riconoscono una specifica sequenza di nucleotidi, ma tagliano il DNA in posizioni non specifiche a una certa distanza dalla sequenza riconosciuta. Poiché il sito di taglio non corrisponde a una specifica coppia di basi, gli enzimi di restrizione del I tipo non sono quasi mai utilizzati nelle tecnologie del DNA ricombinante. Gli enzimi di restrizione del II tipo riconoscono anch’essi specifiche sequenze di nucleotidi, ma tagliano il DNA all’interno di quelle specifiche sequenze, chiamate, come detto prima, siti di restrizione.

La sequenza di riconoscimento per la maggior parte degli enzimi di restrizione del II tipo è lunga 4-6 nucleotidi, ma esistono enzimi di restrizione chiamati rare cutter (tagliatori poco frequenti) che riconoscono sequenze più lunghe. È meglio chiarire subito che la frequenza di taglio di un enzima di restrizione è legata alla lunghezza della sequenza riconosciuta da quello specifico enzima. Infatti, la probabilità che sul DNA si trovi una qualsiasi, ma specifica sequenza di 4 paia di basi è di (1/4)⁴, cioè 1 volta ogni 256 nucleotidi; se la sequenza riconosciuta è lunga 6 paia di basi si troverà statisticamente sul DNA 1 volta ogni 4096 pb (1/4)⁶. È chiaro che enzimi che riconoscano sequenze di 8 pb o più taglieranno il DNA molto raramente (rare cutter).

Enzimi di restrizione isolati da batteri differenti ma che riconoscono e tagliano la stessa sequenza nucleotidica vengono chiamati isoschizomeri. Gli enzimi di restrizione agiscono solo sul DNA estraneo e non tagliano mai il DNA della cellula batterica che li ha prodotti. Il batterio infatti protegge il proprio DNA con un meccanismo chiamato metilazione: alcuni enzimi aggiungono un gruppo metile (CH₃) in tutti i punti del DNA batterico che potrebbero essere riconosciuti dagli enzimi di restrizione.

Gli enzimi di restrizione possono essere estratti dalla cellula che li produce per essere utilizzati in laboratorio come se fossero delle forbici biochimiche. Infatti il DNA di qualsiasi organismo, se incubato in provetta con un enzima di restrizione, verrà tagliato in tutti i punti in cui è presente il relativo sito di restrizione. In seguito al taglio da parte dell’enzima di restrizione si ha la formazione delle cosiddette estremità coesive. Il taglio può essere sfalsato: si formano due frammenti e ciascuno di essi ha un filamento più lungo e uno più corto. Oppure il taglio può essere piatto (più specificamente, detto taglio netto), cioè avviene giusto al centro del sito di restrizione ed anche in questo caso si formano delle estremità adesive: le estremità dell’uno e dell’altro frammento hanno medesima lunghezza.

Le estremità adesive possono unirsi mediante legami idrogeno con estremità adesive complementari derivanti da altri DNA; il DNA ricombinante risultante può essere saldato dall’azione della DNA ligasi.

Il taglio “sfasato” è migliore rispetto a quegli enzimi che determinano un taglio con estremità nette: in questo modo sarà più facile inserire il DNA esogeno nel plasmide. Per identificare siti di restrizione e la loro posizione si possono costruire le cosiddette mappe di restrizione. Queste mappe sono costruite utilizzando un frammento di DNA del quale si conosce la sequenza.

Ad esempio, se prendiamo un frammento di DNA di 1650 pb, è possibile digerirlo con l’enzima EcoRI; in un'altra provetta lo digeriamo con un altro enzima, come BamHI; su un'altra provetta si fa la digestione di quello stesso frammento utilizzando entrambi gli enzimi. Si incuba il tutto a 37°C per una notte e il giorno dopo il prodotto della digestione viene caricato su un gel di agarosio. Si va a vedere in questo modo come migrano le varie bande ottenute con gli enzimi di restrizione. In questo caso si vede che dopo la migrazione, il campione tagliato con EcoRI mostra un frammento di 850 pb (questo valore viene definito utilizzando di fianco un marker di peso molecolare noto), più altri frammenti di varia lunghezza.

Sul pozzetto in cui è presente il DNA digerito con l’enzima BamHI si vedono invece altri frammenti di lunghezza differente rispetto ai primi. Nel pozzetto in cui è stato caricato il campione digerito con entrambi gli enzimi di restrizione, si vedono un’altra serie di bande. Si vede che il frammento di 950 pb ottenuto utilizzando BamHI deve avere al suo interno dei siti di restrizione su cui agisce EcoRI, perché non lo troviamo più nell’ultimo caso (digestione con EcoRI+BamHI): significa che il frammento di 950 pb ha dato origine ai frammenti di 400 pb, 300 pb e 250 pb! Invece il frammento da 600 pb (nella seconda colonna) non contiene al suo interno siti di restrizione per l’enzima EcoRI (infatti lo ritroviamo tale e quale nella terza colonna).

Vettori di clonaggio

Come anticipato precedentemente, dopo aver isolato un determinato gene dal suo genoma di origine per mezzo di enzimi di restrizione e dopo aver digerito una differente molecola di DNA, che deve accogliere questo gene, con altrettanti enzimi di restrizione, si incubano le due molecole così trattate con altri enzimi, quali le DNA ligasi, in modo da incorporare il gene esogeno di interesse nella molecola di DNA di un altro organismo. La molecola che accoglie il gene esogeno di interesse prende il nome di vettore di clonaggio.

Un vettore di clonaggio deve avere alcune caratteristiche particolari:

• Deve contenere un’origine di replicazione che gli permetta di replicarsi autonomamente una volta introdotto all’interno del genoma della cellula ospite. Vettori privi di un’origine di replicazione possono essere utilizzati in casi particolari in cui si vuole integrare del DNA esogeno all’interno del genoma della cellula ospite, magari in precise posizioni (vedi capitolo “Animali transgenici”).
• Deve contenere uno o più marcatori di selezione che permettano di individuare le cellule che contengono il vettore e qualsiasi frammento di DNA in esso inserito.
• Deve contenere il maggior numero possibile di siti di restrizione unici, cioè presenti una sola volta nel loro DNA.

Esistono numerosi vettori di clonaggio. I più semplici, e anche i più usati comunemente, sono: i vettori plasmidici, i vettori fagici o batteriofagi e i vettori cosmidici o cosmidi. Esistono poi altri tipi di vettori di clonaggio che vengono adoperati per soddisfare esigenze particolari: per esempio, i cromosomi artificiali di lievito, conosciuti con l'acronimo YAC, che vengono usati per clonare lunghi segmenti di DNA (oltre 100 Kbp).

Plasmidi

I plasmidi sono i vettori di clonaggio più frequentemente utilizzati nelle tecnologie del DNA ricombinante. Essi sono degli elementi genetici costituiti da molecole di DNA circolare a doppio filamento piuttosto piccole (da 2 a 5 Kbp secondo un libro; da 2 a 200 Kbp secondo un altro libro; da 1 a 500 Kbp secondo la professoressa) e i più utilizzati sono in grado di replicarsi autonomamente all’interno di cellule di E.coli. Sono in grado di replica autonoma, ma non di sopravvivenza autonoma, dato che hanno bisogno di enzimi cellulari per sintetizzare il proprio DNA (è per questo che non si possono trovare liberi in natura, ma sempre all’interno di una cellula).

Si definiscono plasmidi a campo ristretto quelli che si replicano solo all’interno di una specie di cellula ospite, mentre sono plasmidi a campo largo quelli che si replicano in molte specie. Il numero e la specie di cellule ospiti, detto spettro d’ospite, in cui un plasmide si può replicare è variabile e dipende dal tipo di plasmide stesso. Non esistono plasmidi che siano in grado di replicarsi sia nei Gram+ che nei Gram-. I plasmidi generalmente codificano per delle funzioni accessorie, cioè non essenziali (accrescimento e divisione) per la cellula. Tuttavia può succedere che l’informazione portata dai plasmidi diventi fondamentale per la sopravvivenza.

Esempio: se un plasmide porta un carattere di resistenza agli antibiotici e in quell’ambiente in cui è posta la cellula è presente un antibiotico, diventa essenziale esprimere i geni per la resistenza, altrimenti non si sopravvive; i plasmidi potrebbero essere fondamentali anche per la presenza di geni per il metabolismo di particolari sostanze. I plasmidi che non presentano alcuna di tali funzioni vengono definiti criptici. Queste molecole vengono solitamente segregati in modo “verticale” (dalla cellula madre alle cellule figlie), ma possono anche essere trasferiti in modo “orizzontale” (da una cellula alla cellula vicina). Il numero tipico di copie plasmidiche all’interno di una cellula varia in modo significativo: ci sono plasmidi che raggiungono un numero di copie che supera il centinaio, e altri che si mantengono con una o due copie per cellula. Più piccolo è il plasmide e maggiori saranno il numero di copie, viceversa più sarà grande e meno saranno le copie. Nella stessa cellula possono essere presenti plasmidi differenti, ciascuno in un certo numero di copie (si possono avere da 8 a 10 plasmidi differenti).

Alcuni tipi di plasmide sono in grado di integrarsi nel cromosoma del batterio, inserendo quindi il loro DNA nel genoma dell’ospite. Plasmidi di questo tipo, che possono trovarsi nella forma integrata o nella forma extracromosomica, sono denominati episomi. Molti dei plasmidi presenti in natura contengono già dei marcatori selettivi che conferiscono alle cellule batteriche che contengono tali plasmidi la resistenza ad alcune sostanze, per esempio a degli antibiotici. Il plasmide pBR322 (“p” sta per plasmide; “B” e “R” sono le iniziali dei nomi dei ricercatori che lo hanno messo a punto; 322 indica il numero dell’esperimento) è il prototipo da cui sono stati derivati numerosi altri plasmidi utilizzati in tecniche di clonaggio molecolare. Il plasmide pBR322 contiene un’origine di replicazione che gli permette di replicarsi autonomamente in cellule di E.coli; presenta anche due geni (indicati con Amp e Ter) che consentono alle cellule batteriche che contengono il plasmide di poter crescere in presenza degli antibiotici penicillina e tetraciclina. Nell’immagine sottostante che rappresenta, appunto, il plasmide pBR322 vengono indicati anche i siti UNICI di restrizione che vengono riconosciuti da specifici enzimi di restrizione.

Vediamo ora le fasi per trasferire una sequenza di DNA esogeno all’interno di un plasmide:

• Innanzitutto bisogna estrarre il plasmide e digerirlo con uno specifico enzima di restrizione (lo stesso che verrà utilizzato per estrapolare la sequenza di DNA esogeno dal suo genoma di origine).
• Il vettore, in questo caso il plasmide, deve essere trattato anche con la fosfatasi alcalina, un enzima che rimuove i gruppi fosfato dall’estremità coesive che si formano in seguito all’azione dell’enzima di restrizione. In questo modo si evita che le estremità coesive appena create si richiudano.