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Real-time PCR

La Real-time PCR è una tecnica avanzata di amplificazione del DNA che consente di monitorare il progresso della PCR in tempo reale. Questa metodica offre la possibilità di quantificare il DNA o l'RNA presente in un campione attraverso la misurazione dell'intensità della fluorescenza generata durante la reazione.

Principi base della Real-time PCR

• Amplificazione: Come nella PCR convenzionale, il DNA target viene amplificato attraverso cicli di denaturazione, annealing e estensione.
• Detezione fluorescente: La differenza principale con la PCR convenzionale è che nella Real-time PCR si utilizzano sonde fluorescenti o coloranti intercalanti per monitorare la reazione. La fluorescenza aumenta proporzionalmente alla quantità di DNA amplificato, consentendo di quantificare il target in modo continuo durante il processo.

PCR quantitativa vs. PCR convenzionale

• PCR Convenzionale: In questa metodica, i prodotti di amplificazione vengono analizzati a posteriori, generalmente tramite elettroforesi su gel. Non è possibile quantificare esattamente il DNA target, ma solo rilevarne la presenza.
• PCR Quantitativa (Real-time PCR): Consente di quantificare il DNA in tempo reale durante il ciclo di amplificazione. Si basa su misurazioni di fluorescenza per ogni ciclo, permettendo di determinare la quantità iniziale di DNA attraverso curve standard o metodi di quantificazione relativa.

Tipologie di Real-time PCR

Le principali tecnologie di Real-time PCR si differenziano per il metodo di rilevazione della fluorescenza:

SYBR Green

• Principio: Utilizza un colorante fluorescente, SYBR Green, che si intercalando tra le basi del DNA doppio filamento. Quando il DNA viene amplificato, la fluorescenza aumenta.
• Vantaggi: Semplice ed economico, poiché non richiede sonde specifiche.
• Svantaggi: La specificità è inferiore rispetto ad altre tecnologie, poiché il colorante si lega a qualsiasi DNA doppio filamento, inclusi i prodotti non specifici.

TaqMan

• Principio: Utilizza una sonda specifica marcata con fluorescenza e un quencher. La sonda si lega al DNA target durante l'annealing. Durante l'estensione, l'attività della Taq polimerasi degrada la sonda, liberando il segnale fluorescente.
• Vantaggi: Elevata specificità e sensibilità, poiché il segnale è generato solo in presenza del DNA target.
• Svantaggi: Maggiore costo rispetto a SYBR Green, poiché richiede la progettazione di sonde specifiche.

Scorpions

• Principio: Combina le proprietà delle sonde e dei primer in un'unica molecola. La sonda ha una struttura che si ripiega, mantenendo il quencher vicino alla parte fluorescente. Durante l'amplificazione, la sonda si lega al DNA target e si apre, liberando il segnale fluorescente.
• Vantaggi: Maggiore sensibilità e specificità rispetto ad altre tecnologie.
• Svantaggi: Richiede una progettazione più complessa delle sonde.

Beacons

• Principio: Sonda fluorescente che si chiude su se stessa in assenza di DNA target, mantenendo il quencher vicino al fluorocromo. Quando la sonda ibrida con il target, si apre, portando alla liberazione della fluorescenza.
• Vantaggi: Elevata specificità e capacità di monitorare l'ibridazione in tempo reale.
• Svantaggi: Costi elevati e progettazione complessa.

Digital droplet PCR (ddPCR)

• Principio: Consente la quantificazione assoluta del DNA. Il campione viene suddiviso in migliaia di gocce, e ciascuna goccia funge da reazione PCR separata. La presenza del DNA target in ciascuna goccia è misurata, fornendo una quantificazione altamente precisa.
• Vantaggi: Quantificazione assoluta senza necessità di curve standard e maggiore sensibilità, specialmente in campioni con bassa abbondanza di target.
• Svantaggi: Maggiore costo e necessità di attrezzature specializzate.

Conclusione

La Real-time PCR rappresenta una tecnologia cruciale per la quantificazione del DNA e dell'RNA, con applicazioni in genetica, biologia molecolare e diagnostica. Le diverse tipologie di Real-time PCR offrono opzioni per vari requisiti di specificità, sensibilità e costo, rendendo questa tecnica versatile per diverse applicazioni scientifiche e cliniche.

Mutagenesi

La mutagenesi è un insieme di tecniche utilizzate per introdurre cambiamenti nel materiale genetico (DNA) di un organismo. Queste modifiche possono essere utilizzate per studiare le funzioni geniche, migliorare le caratteristiche di organismi o enzimi, e sviluppare nuove funzionalità. Le tecniche di mutagenesi possono essere classificate in diverse categorie a seconda del metodo utilizzato.

Tipologie di mutagenesi

Mutagenesi con oligonucleotidi

• Descrizione: Utilizza oligonucleotidi sintetici per introdurre mutazioni specifiche in un gene. Gli oligonucleotidi contengono una sequenza che corrisponde al gene target, ma con una o più modifiche (come sostituzioni, inserzioni o delezioni).
• Procedura:
  1. Gli oligonucleotidi vengono progettati per ibridarsi al DNA target.
  2. Si esegue una reazione di PCR o una reazione di annealing per amplificare il gene con le mutazioni desiderate.
  3. Il prodotto amplificato viene utilizzato per trasformare cellule competenti.

Mutagenesi con ceppi dut/ung

• Descrizione: Utilizza ceppi batterici carenti di enzimi specifici per la riparazione del DNA, come dut (deossiuridina trifosfato) e ung (uracile N-glicosilasi). Questi ceppi sono incapaci di riparare alcune mutazioni indotte.
• Procedura:
  1. Si introduce un plasmide contenente il gene target nel ceppo dut/ung.
  2. Si utilizza una fonte di nucleotidi modificati (come l'uracile) per indurre mutazioni.
  3. Le cellule vengono poi selezionate per il mantenimento della mutazione, poiché non possono ripararla.

Mutagenesi con oligonucleotidi e PCR

• Descrizione: Questa tecnica combina l'uso di oligonucleotidi e la PCR per generare mutazioni. Gli oligonucleotidi contengono le mutazioni desiderate e vengono utilizzati come primer nella PCR.
• Procedura:
  1. Si progettano oligonucleotidi che includono le mutazioni.
  2. Si esegue una PCR con questi primer per amplificare il gene.
  3. La PCR produce DNA mutato che può essere utilizzato per ulteriori esperimenti o trasformazioni.

DNA shuffling

• Descrizione: È una tecnica che consente di creare una libreria di varianti di un gene attraverso il riarrangiamento del DNA. Questa tecnica è particolarmente utile per l'evoluzione di proteine.
• Procedura:
  1. Si amplificano diversi frammenti di un gene target.
  2. I frammenti vengono poi miscelati e riassociati per formare nuovi geni.
  3. I geni riassociati vengono amplificati e clonati in un vettore per analisi successive.

Error prone PCR

• Descrizione: Questa tecnica utilizza una PCR condotta in condizioni che inducono errori nella replicazione del DNA. È utile per generare una libreria di varianti casuali di un gene.
• Procedura:
  1. La PCR viene eseguita utilizzando una polimerasi DNA con una bassa fedeltà.
  2. Il prodotto della PCR contiene mutazioni casuali che possono essere selezionate per funzioni desiderate.
  3. I frammenti mutati vengono clonati in vettori e testati.

StEP (Staggered Extension PCR)

• Descrizione: StEP è una variante della PCR utilizzata per generare mutazioni casuali. Consiste nell'estensione di primer che presentano un'overhang asimmetrica.
• Procedura:
  1. Si utilizzano primer progettati per avere sequenze di sovrapposizione con il DNA target.
  2. Durante la PCR, le diverse estensioni generano mutazioni casuali.
  3. I prodotti vengono amplificati e selezionati per ulteriori studi.

Evoluzione molecolare guidata

• Descrizione: È un approccio sistematico per ottimizzare le proteine attraverso la selezione e la modifica delle sequenze geniche. In pratica, si introducono mutazioni nel gene di interesse e si selezionano varianti con caratteristiche desiderate.
• Procedura:
  1. Si genera una libreria di varianti mutanti utilizzando una delle tecniche di mutagenesi.
  2. Le varianti vengono testate per la funzione o l'attività desiderata.
  3. Le migliori varianti vengono amplificate e utilizzate per successive cicli di mutagenesi e selezione.

Conclusione

La mutagenesi è una tecnica fondamentale nella biologia molecolare e nella biotecnologia, poiché consente di studiare e migliorare le funzioni geniche e proteiche. Le diverse tecniche di mutagenesi offrono approcci flessibili e adattabili per l'ottimizzazione di geni e proteine per vari scopi, dalle ricerche di base all'industria biotecnologica.

Espressione di proteine ricombinanti in E. coli

L'espressione di proteine ricombinanti in E. coli è una tecnica ampiamente utilizzata in biotecnologia per produrre proteine in grandi quantità. E. coli è scelto come ospite per la sua crescita rapida, costi relativamente bassi e ben caratterizzato sistema genetico.

Scelta dei vettori e caratteristiche ottimali dei vettori di espressione

• Vettori di espressione: I vettori utilizzati per l'espressione di proteine in E. coli devono contenere diversi elementi chiave:
  • Origine di replicazione: Permette la duplicazione del vettore all'interno della cellula.
  • Promotore: Regola l'inizio della trascrizione del gene d'interesse. Promotori forti, come il T7, sono comunemente usati per garantire alta espressione.
  • Sequenza di terminazione: Indica la fine della trascrizione.
  • Marker di selezione: Permette l'identificazione delle cellule che contengono il vettore, spesso attraverso antibiotici.
• Caratteristiche ottimali:
  • Facilità di clonaggio: I vettori devono consentire l'inserimento semplice del gene d'interesse.
  • Alte rese: Dovrebbero permettere l'espressione di grandi quantità di proteina.
  • Stabilità: Devono mantenere la stabilità genetica durante le divisioni cellulari.

Tag di affinità

I tag di affinità sono sequenze di aminoacidi aggiunte alle proteine ricombinanti per facilitarne la purificazione. Questi tag possono legarsi a resine specifiche durante il processo di purifica...