Clonaggio DNA

Questo non è l’unico modo in cui possiamo clonare il DNA. Ci

 sono altri metodi offerti dai procedimenti messi appunto dalla

metagenomica che studia il materiale genetico recuperato da

campioni ambientale. Questo vuol dire che non per forza

dobbiamo avere a che fare con cellule vive.

Nei campioni ambientali il DNA viene processato e ci dà la

 possibilità, attraverso il sequenziamento di questo, di

riconoscere specifiche funzioni con l’analisi bioinformatica.

I progetti di metagonomica rappresentano un punto di

 partenza anche per la produzione di proteine ricombinanti che

non ha a che vedere con l’isolamento di specie o di tessuti in

database

modo diretto. Inoltre rendono sempre più ampio il

di informazioni sulla funzione delle proteine. Questo

permette di consultare un database nel momento in cui sono

interessata alla produzione di una proteina o di un enzima con

determinate caratteristiche.

Questo significa che abbiamo gli strumenti per saltare la

 generazione del vettore plasmidico e sintetizzare direttamente

molecole di DNA attraverso metodi chimici. Si può sintetizzare

solo la sequenza del gene target o anche l’insieme costituito

da gene e vettore.

Gene cloning = produzione di copie multiple di un frammento

 di DNA una volta che è stato inserito nel circolo di DNA

plasmidico (amplificato nelle cellule batteriche). I circoletti di

DNA in cui è inserito il gene codificante per la proteina di

interesse sono dotati di elementi di replicazione autonoma che

consentono la moltiplicazione.

DNA target = sequenza genica codificante per la proteina di

 interesse. (GOI= gene of interest; POI=protein of interest)

DNA carrier = DNA plasmidico in cui il GOI è inserito. Viene

 copiato indipendentemente dal resto del materiale genetico

della cellula ospite.

Possono ricorrere ad un sistema di assemblaggio delle

 molecole di DNA di tipo enzimatico: utilizzo una serie di enzimi

per mettere insieme le molecole di DNA del vettore plasmidico

che utilizzo prima per amplificare il DNA e poi per promuovere

la produzione della proteina ricombinante.

La reazione enzimatica di frammentazione consente la

 scissione del frammento di DNA corrispondente al gene. Altre

reazioni enzimatiche consentono di linearizzare il DNA

plasmidico e successivamente un’altra reazione consente la

ligazione del target DNA e del vettore di clonaggio formando

così il DNA plasmidico di tipo ricombinante.

A questo punto il DNA plasmidico deve essere estratto da un

 ceppo che abbiamo sfruttato per l’amplificazione del DNA e

purificato.

Il DNA viene poi utilizzato per trasformare la cellula ospite (di

 solito escherichia coli) e da qui ho la possibilità di produrre la

proteine ricombinante che sarà soggetta ad una serie di

estrazioni e purificazioni.

Enzimi usati nel clonaggio del DNA

Enzimi usati: enzimi di restrizione, fosfatasi (che hanno a che

 vedere con il trasferimento di gruppi fosfati) e ligasi.

1)Enzimi di restrizione

Alcune famiglie di enzimi di restrizione possono essere

 utilizzate come strumenti di clonaggio.

La loro scoperta deriva dall’identificazione di meccanismi di

 difesa attuati da cellule batteriche: gli enzimi batterici possono

degradare DNA esogeno (ad esempio di origine virale)

attraverso utilizzo di enzimi che frammentano il DNA che non

viene riconosciuto come self.

La famiglia di enzimi di restrizione che noi utilizziamo come

 cloning tools sono quelli che appartengono alla famiglia

ENDONUCLEASI DI TIPO II

2

Questi riconoscono e tagliano dalle sequenze palindromiche di

 DNA che hanno una lunghezza variabile da 8 a 4 paia di basi.

Il taglio proteolitico può avvenire in una posizione più o meno

distante rispetto alla sequenza che viene riconosciuta. Questo

tipo di enzimi invece riconoscono direttamente la sequenza di

taglio e il taglio avviene all’interno della sequenza

riconosciuta. Sono i più diffusi in questo tipo di procedure.

Esempio: /= sito del taglio su ciascuno dei due

filamenti di DNA

Passaggi coinvolti nel riconoscimento e nel taglio del DNA da

 parte di enzimi di REs: questo riconosce la sequenza target

attraverso un meccanismo di diffusione lineare (data dal fatto

che la formazione del complesso tra la molecola di DNA e

quella dell’enzima non è così salda, mentre invece lo è quando

si verifica il riconoscimento della regione specifica; il

complesso diventa più compatto) la molecola enzimatica

scorre sulla molecola fino al riconoscimento della sequenza di

taglio. Gli enzimi di REs che conosciamo richiedono la catalisi

degli ioni di magnesio. Esistono dei tamponi (catalizzanti)

universali.

Sulla sequenza riconosciuta avviene la reazione di catalisi e la

 rottura del legame fosfodiesterico. Due enzimi ad esempio

sono : EcoR 1 (di tipo 2P) ed EcoR 5.

Il taglio in posizione sfalsate sui due lineamenti dà la

 sticky o

possibilità di generare delle estremità definite

coesive complementari, in grado di ibridizzare ognuna delle



estremità generate dal taglio contiene una sequenza

protrudente rispetto al punto in cui avviene l’appaiamento dei

due filamenti del DNA. (EcoR 1 è uno di quegli enzimi che

tipicamente producono estremità protrudenti al 5’di entrambi i

filamenti).

In altri casi (vedi EcoR 5) il taglio avviene in posizioni allineate

 piatte o

sui due filamenti e produce delle estremità definite

blunt end .

Denominazione enzimi: ordine di caratterizzazione R1

 

perché è estato il primo ad essere isolato da cellule di

Escherichia coli. La parte del nome riferita all’organismo (eco

ad esempio) va scritto in corsivo.

Gli enzimi di REs quindi ci servono per tagliare circoletti di DNA

 e le molecole del gene target che andranno inserite nel

vettore.

1)Vettori di clonaggio: plasmidi

Plasmide = è una molecola circolare di DNA a doppio

 filamento, in grado di replicarsi autonomamente dal

cromosoma.

Un plasmide possiede:

 1) Un’origine replicativa (ori)

2) Almeno un gene di resistenza ad un antibiotico, per esempio

all’ampicillina, che funga da marker di selezione

3) Un multicloning site (o polylinker)= regione del DNA

contenente diversi siti di taglio per enzimi di restrizione

maggiore la varietà di enzimi di REs presenti all’interno del

polylinker maggiori sono le opportunità di clonare dei

frammenti di DNA che siano delimitati da diverse sequenze.

Bisogna rendere compatibili le sequenze di DNA plasmidico

con quella della molecola di DNA che vogliamo clonare al

suo interno.

Clonaggio con estremità coesive

Il sito di restrizione è presente all’interno del multiple cloning

 site del vettore (molecola di DNA che funge da accettore).

Plasmide e DNA estraneo vengono tagliati con lo stesso

 enzima di restrizione, che genera sticky ends le estremità

sono generate dallo stesso enzima quindi il DNA estraneo per

poter essere clonato nel plasmide deve presentare lo stesso

tipo di estremità.

Le estremità protrudenti devono essere complementari tra

 quelle del frammento e quelle del DNA plasmidico le



estremità si appaiano spontaneamente, ma è possibile anche il

riappaiamento delle estremità del plasmide (si richiude).

L’appaiamento può avvenire tra estremità protrudenti

compatibili.

Il re-annealing è un evento più probabile rispetto

 all’integrazione del DNA dell’inserto perché la reazione è

monomolecolare.

Per promuovere l’integrazione del DNA ricombinante si può

 aumentare il numero di molecole di inserto rispetto al numero

di molecole del vettore. (si va da 1:3 a 1:6). Un altro metodo è

utilizzare un enzima di modificazione del DNA (fosfatasi)

che ha la funzione di idrolizzare il gruppo P presente sulle due

estremità 5’ protrudenti del vettore questo produce

incapacità di self-ligation da parte del plasmide.

ANNEALING RE-ANNEALING

= appaiamento

 

= auto appaiamento

Questo non succede quando utilizzo un enzima che produce

 delle estremità piatte queste fanno si che i frammenti

generati dal plasmide possano accogliere un frammento

generato con qualunque enzima di restrizione.

Questa mancanza di complementarietà però rende, da un

 punto di vista termodinamico, la formazione de legame

covalente stabile catalizzato dalla DNA ligasi, meno probabili,

perché l’appaiamento che precede la formazione di questo

legame vero e proprio meno probabile per questo in

soluzione si mettono più vettori e più inserti di DNA.

In realtà per quanto riguarda le estremità coesive l’importante

 è che ci sia complementarietà tra le estremità protrudenti e

non su tutta la sequenza dell’enzima di restrizionequesto

comporta che anche enzimi diversi hanno la possibilità di

produrre estremità sticky compatibili c’è più libertà nella



scelta degli enzimi.

Altra conseguenza è che tutte le volte che metto insieme

 molecole che non rigenerano la polindrome perfetta perdo

l’identità del sito di restrizione.

Dove ci sono le X, non ci devono per

forza essere sequenze di DNA

coincidenti le estremità devono

essere compatibili ma X non deve

essere per forza uguale a X o a X. Il

gene target può essere ottenuto con un

singolo Eres o con due Eres diversi.

L’inserimento di DNA può avvenire in entra entrambi gli

 orientamenti perché la molecola è simmetrica rispetto alle due

estremità. (50% in un senso e 50% nell’altro).

Clonaggio con estremità non coesive

Un altro modo per impedire il re-annealing è l’utilizzo di due

 differenti enzimi di restrizione che producono estremità che

non sono compatibili che devono però essere

necessariamente presenti sia sulle estremità del vettore che

su quella dell’inserto il re- annealing non può avvenire e la

possibilità di richiudere il circoletto di DNA è data solo dalla

presenza di un frammento di DNA che abbia delle estremità

compatibili.

Una conseguenza di questo è che abbiamo la possibilità di

 direzionare l’orientamento dell’inserto nella molecola di DNA.

Quando si verifica l’appaiamento si hanno delle molecole di

 DNA definite nickato cioè con una discontinuità disallineata sui

due filamenti di