Legame peptidico

La reazione viene condotta aggiungendo una soluzione di Anidride acetica e piridina in DMF, in

modo da dare formare l’ammide corrispondente:

Deprotezione dell’-NH

7 della catena principale del secondo amminoacido

2

Trattandosi di Fmoc-SPPS, verrà condotto in ambiente basico: soluzione di dimetilformammide

→

(DMF) con 20% v/v di piperidina vedi step 3

[Avendo previsto un passaggio di capping precedente, ora gli unici siti di attacco saranno gli -NH

2

liberi di L-Glu] →

8 Attacco del terzo amminoacido (Fmoc-L-Phe-OH) vedi step 4

qualitativa dell’avvenuto attacco (es. test Kaiser),

9 Verifica se presenti ancora -NH liberi,

2

procedere con un secondo step di coupling (identico al punto 8)

Deprotezione dell’-NH

10 della catena principale del terzo ed ultimo amminoacido

2

Trattandosi di Fmoc-SPPS, verrà condotto in ambiente basico: soluzione di dimetilformammide

→

(DMF) con 20% v/v di piperidina vedi step 3

[N.B. come avrete notato qui non vi è uno step di capping prima della deprotezione, questo solo

perché si tratta dell’ultimo amminoacido. Non dovendo più procedere con un attacco successivo,

non è necessario proteggere le ammine irreagite dell’amminoacido 2]

11 Distacco del tripeptide dalla resina

La resina con peptide attaccato viene pesata e si prepara una soluzione di TFA con degli

scavengers di radicali per bloccare le protezioni ai gruppi R che verranno rimosse e limitare

reazioni secondarie.

Perché TFA (acido trifluoroacetico)?

Ricordiamoci che la SPPS è una sintesi ortogonale, per cui tutte le protezioni ai gruppi R degli

amminoacidi si potranno rimuovere in ambiente acido (vedi considerazioni al punto a)

Scavengers (spazzini): vengono scelti in funzione dei gruppi presenti sulle catene laterali. Nel

nostro caso abbiamo un acido (-COOH di L-Glu) e un tiolo (-SH di L-Cys).

La soluzione opportuna prevederà presenza di acqua (2.5%), triisopropilsilano (1%) e

etanditiolo (2.5%) in TFA (94%).

12 Precipitazione del peptide staccato dalla resina, purificazione e caratterizzazione.

4) Quali sono i passaggi della sintesi peptidica in fase solida?

1 Rigonfiamento della resina

2 Attivazione e/o deprotezione della resina

3 COUPLING primo a.a. (accoppiamento con agenti attivanti)

4 Deprotezione -NH del primo amminoacido

2

5 COUPLING secondo amminoacido

Verifica qualitativa dell’avvenuto attacco (es. test Kaiser)

6

7 CAPPING (protezione degli eventuali -NH del primo amminoacido non reagiti)

2

8 fino all’attacco dell’ultimo amminoacido necessario

8 Ricomincio da punto

9 Distacco del peptide dalla resina

10 Precipitazione e purificazione del peptide

5) Proporre una strategia di sintesi per il tripeptide: H N-Lys-Leu-Gly-COOH

2

A questo punto, seguire le considerazioni dell’es. 3:

la sintesi in fase solida procede "da destra verso sinistra", ovvero:

l'amminoacido che possiede il C terminale viene attaccato alla resina di supporto per primo (nel nostro caso

sarà la Boc-Gly)

1 Rigonfiamento della resina (per favorire la penetrazione dei reagenti nei granuli)

nel nostro caso scegliamo una resina per Boc-SPPS con rilascio del C-terminale libero, es. resina

Merrefield:

2 Attivazione della resina con attacco del primo amminoacido (Boc-L-Gly-OH)

Ricordiamo che le attivazioni delle resine, ovviamente, dipendono dalla resina utilizzata, in questo

caso:

Deprotezione dell’-NH

3 della catena principale del primo amminoacido

2

Trattandosi di Boc-SPPS, verrà condotto in ambiente acido: TFA/CH Cl al 30%, a freddo.

2 2

risoluzione dell’es.

Da qui in poi, fare riferimento alla 3

4 Attacco del secondo amminoacido (Boc-L-Leu-OH) che viene:

–

-precedentemente attivato (es. carbodiimidi + HOBt vedi slides lez. sintesi peptidica), e poi

aggiunto al reattore in cui avviene la sintesi

-oppure, attivato in situ (es. PyBOP, DIPEA)

qualitativa dell’avvenuto attacco (es. test Kaiser),

5 Verifica se presenti ancora -NH liberi,

2

procedere con un secondo step di coupling (identico al punto 4)

6 CAPPING: protezione degli eventuali -NH del primo amminoacido non ancora reagiti, in modo

2

da far procedere la sintesi secondo l’ordine stabilito dal peptide voluto (evitare che il terzo

amminoacido si attacchi al primo e non al secondo)

Deprotezione dell’-NH

7 della catena principale del secondo amminoacido

2

Trattandosi di Boc-SPPS, verrà condotto in ambiente acido: TFA/CH Cl al 30%, a freddo.

2 2

→

8 Attacco del terzo amminoacido (Fmoc-L-Lys(Z)-OH) vedi step 4

qualitativa dell’avvenuto attacco (es. test Kaiser),

9 Verifica se presenti ancora -NH liberi,

2

procedere con un secondo step di coupling (identico al punto 8)

Deprotezione dell’-NH

10 della catena principale del terzo ed ultimo amminoacido

2

Trattandosi di Boc-SPPS, verrà condotto in ambiente acido: TFA/CH Cl al 30%, a freddo.

2 2

11 Distacco del tripeptide dalla resina

Trattandosi di Boc-SPPS avremo le seguenti possibilità:.

• HF → Peptide acido

• /MeOH → Peptide carbossammide

NH

3

• → Peptide idrazide

NH NH

2 2

• MeOH/TEA → Peptide metilestere

12 Precipitazione del peptide staccato dalla resina, purificazione e caratterizzazione.

6) Evidenzia i gruppi protettivi presenti. Che protezioni ortogonali proporresti per i seguenti

amminoacidi, se possibili, per usarli in SPPS e a quale gruppo funzionale?

Tutti quelli che troverete sono esempi di gruppi protettivi alternativi, per completezza riguardare le slides

7) Qual è la struttura chimica di HOBt, a cosa serve e come si usa?

L’idrossibenzotriazolo è una molecola organica che viene principalmente utilizzata per

sopprimere la racemizzazione delle molecole chirali e per migliorare l'efficienza della

sintesi peptidica. La sintesi peptidica comporta la condensazione del gruppo amminico di

aminoacidi protetti (sulle catene laterali) con un estere attivato. HOBt è usato come