2. Tecniche per lo studio delle proteine plasmatiche (elettroforesi delle sieroproteine, metodo di kjeldhal, metodo del biureto, metodo di folin-lowry, metodo di bradford) + descrizione delle più importanti proteine plasmatiche

Proteine plasmatiche: generalità

Il plasma è costituito per il 90% da acqua e per il 10% circa da soluti:

• Proteine (6.3-8.0g/100ml)
• Sali inorganici (1.0-1.2g/100ml)
• Composti organici di varia natura (1-1.5g/100ml)

Le proteine plasmatiche sono un insieme di macromolecole che circolano nel sangue, ricoprendo diverse funzioni: trasporto di sostanze liposolubili (e quindi insolubili in acqua, che è il principale componente del plasma); intervengono nella risposta immunitaria, nella coagulazione del sangue, nei processi infiammatori ecc.

Le proteine plasmatiche, sulla base della solubilità, possono essere distinte in:

• Albumine (solubili in acqua)
• Globuline (solubili in soluzioni saline diluite).

Tipi di globuline

• α-1 globuline, cui appartiene l’α-1 antitripsina
• α-2 globuline, cui appartengono α-macroglobulina, aptoglobulina, ceruloplasmina
• β-globuline, cui appartengono la transferrina e la β-microglobulina
• γ-globuline, cui appartengono le immunoglobuline (o anticorpi) e la transferrina.

Le proteine plasmatiche sono sintetizzate in netta prevalenza dal fegato. Fra le proteine di origine extraepatica, vi sono le immunoglobuline (sintetizzate dalle plasmacellule). Le immunoglobuline, o anticorpi, sono molecole che vengono sintetizzate col fine di riconoscere, evidenziare e uccidere agenti estranei che invadono un determinato organismo. Esse vengono sintetizzate dai linfociti, cellule facenti parte del sistema immunitario.

I linfociti B che non hanno incontrato nessun antigene prendono il nome di linfociti B naive (vergini); mentre, nel momento in cui questi incontrano e riconoscono un antigene tramite recettori di membrana (cioè delle immunoglobuline, quali D ed M, espresse costitutivamente sulla loro membrana), subiscono un processo di attivazione, chiamato switching isotopico, grazie al quale i linfociti B naive diventano plasmacellule, cioè cellule in grado di produrre specifiche immunoglobuline mirate contro uno specifico antigene.

Nelle slide c'è scritto che le immunoglobuline sono prodotte dalle cellule ematiche del reticolo immunoglobuline, che è un sistema funzionale dell’organismo. Le cellule reticolari si localizzano nei linfonodi dove si organizzano a formare delle trabecole, attorno alle quali si localizzano i linfociti. Altre proteine plasmatiche che non vengono prodotte dal fegato sono le proteine del complemento (prodotte dai macrofagi, altre cellule facenti parte del sistema immunitario).

In realtà queste proteine vengono prodotte principalmente dai macrofagi, ma in minima parte anche dagli epatociti. Queste proteine sono degli importanti mediatori nei processi infiammatori e di difesa dell’organismo. Esse, appartenenti alla categoria delle globuline, sono presenti nel sangue come molecole funzionalmente inattive; dopo l’attivazione, esse sono capaci di interagire tra loro, con gli anticorpi o con le membrane cellulari, svolgendo molteplici attività biologiche che comprendono la morte delle cellule.

Anche alcune apolipoproteine non vengono sintetizzate dal fegato, ma dall’intestino. Queste proteine plasmatiche sono capaci di legare i lipidi e di mediare il loro trasporto.

Funzioni delle proteine plasmatiche

Le funzioni biologiche delle proteine del plasma sono molteplici e non sempre completamente conosciute. Tra le varie funzioni svolte da queste proteine si annoverano le seguenti:

Funzione nutritiva

Ascrivibile largamente alla frazione albuminica. In un adulto vengono normalmente degradati e ricostituiti ogni giorno 15-20g di proteine plasmatiche, con un emi-vita media intorno ai 10 giorni. La forte quantità di aminoacidi che si libera da questo rapido turnover viene utilizzata a scopo energetico, per produrre, dopo deaminazione, lipidi e glucidi, o infine per ricostituire molecole proteiche nei vari tessuti e in modo particolare nel fegato.

Funzione tampone

Prima di capire come fanno le proteine plasmatiche a svolgere questa funzione, è bene dire che le soluzioni tampone sono soluzioni contenenti miscele di soluti che impediscono significative variazioni di pH. Queste soluzioni possono contenere contemporaneamente, in concentrazioni all’incirca uguali, un acido debole e la sua base coniugata oppure una base debole e il suo acido coniugato.

Un esempio di soluzione tampone è la soluzione costituita da acido acetico (CH₃COOH), che è un acido debole, e l’acetato di sodio (CH₃COONa). L’acido acetico essendo debole si dissocia parzialmente:

Mentre l’acetato di sodio si dissocia completamente:

L’acetato di sodio ha lo scopo di aumentare la concentrazione dello ione CH₃COO^-, cioè lo stesso ione che si forma in piccole quantità dalla dissociazione dell’acido acetico. In questo modo si ottiene una soluzione con concentrazione di CH₃COOH e CH₃COO^- molto vicine tra loro; ed è proprio questo che determina l’effetto tamponante della soluzione.

Se una soluzione tende a diventare acida, l’effetto viene annullato dall’anione (in questo caso CH₃COO^-), che ruba gli ioni H⁺; se una soluzione tende a diventare basica per la liberazione di ioni OH^-, questi tendono a neutralizzare l’idronio (H₃O⁺).

Tuttavia, la situazione è equilibrata dalla produzione di altre molecole di idronio derivanti dalla dissociazione dell’acido. Nel caso delle proteine plasmatiche avviene una situazione analoga. In questo caso la funzione tamponante dipende molto dal gruppo imidazolico dell’istidina di queste proteine.

Istidina: gruppo imidazolico

Il gruppo imidazolico dell’istidina è parzialmente protonato; il suo pKa=6.0. Questo significa che quando il pH della soluzione è uguale a 6.0, e cioè quando il pH=pKa=6.0, il gruppo imidazolico si trova per il 50% in forma protonata e per il 50% in forma dissociata.

Quindi se il pH della soluzione è compreso tra (pKa – 1) e (pKa + 1), e cioè se il pH della soluzione è compreso tra 5 e 7 il gruppo imidazolico si troverà in parte protonato e in parte dissociato. Quindi è una situazione simile a quella di una soluzione tampone in cui c’è l’acido e la sua base coniugata visti precedentemente. Se il pH della soluzione è troppo più basso del pKa, il gruppo imidazolico si troverà prevalentemente in forma protonata; se il pH della soluzione è troppo più alto del pKa, il gruppo imidazolico si troverà prevalentemente in forma dissociata.

Visto che il pH del sangue è leggermente basico, è possibile che questo determini la prevalenza di proteine in forma anionica (dissociata).

Mantenimento della pressione oncotica

Per spiegare cosa è la pressione oncotica, o anche detta colloido-osmotica, bisogna immaginare un recipiente diviso in due comparti da una membrana permeabile all’acqua. In un comparto, l’acqua contiene una maggior concentrazione di soluti; nell’altro comparto, l’acqua presenta una minore concentrazione di soluti. Quindi l’acqua tenderà a passare dal comparto a minore concentrazione a quello a maggiore concentrazione, bilanciando così le concentrazioni dei due comparti.

Dobbiamo immaginare che il passaggio dell’acqua è come se fosse dovuto a un peso che esercita una pressione sull’acqua meno concentrata (cioè con una minore concentrazione di soluti). Quella pressione è chiamata, appunto, pressione oncotica. Le proteine plasmatiche presenti nel plasma, quindi, richiamano acqua dal liquido interstiziale verso l’interno dei vasi sanguigni. La pressione oncotica esercitata dalle proteine plasmatiche è pari a 18mmHg.

L’albumina gioca anch’essa un ruolo fondamentale nel richiamare acqua all’interno dei vasi sanguigni, infatti essa a pH 7,4 possiede 16 cariche negative esposte sulla sua superficie che attraggono intorno alla sua molecola un alone di acqua, che si aggiunge a quella richiamata dall’esterno per l’azione osmotica vera e propria. In caso di una forte diminuzione dell’albumina, l’acqua tende ad abbandonare lo spazio intravascolare e a diffondere in quello interstiziale provocando l’edema.

In realtà, il sangue esercita una pressione idrostatica sulle pareti dei vasi, la quale pressione permette inizialmente una fuoriuscita di liquidi dai vasi stessi verso l’interstizio. Gran parte di questa quantità di liquidi rientra nei vasi per il motivo descritto prima e una piccola parte raggiunge i vasi linfatici. Questo meccanismo permette di cedere le sostanze nutritive alle cellule. Questo tipo di movimento avviene prevalentemente a livello dei capillari, che hanno pareti più sottili e più permeabili.

Funzione di trasporto

Le proteine plasmatiche assicurano il trasporto in circolo di numerose sostanze esogene o endogene, che diversamente risulterebbero insolubili in acqua (lipidi, ormoni steroidei, tiroxina, vitamine, bilirubina, farmaci o sostanze tossiche). In alcuni casi, le proteine plasmatiche possono legare alcuni metalli (ferro, rame, calcio), rendendoli atossici o fisiologicamente meno attivi.

Coagulazione

La maggior parte delle proteine coinvolte in questi processi sono presenti allo stato attivo o come precursori nel plasma; altre proteine interessate nel meccanismo emocoagulativo vengono liberate nel plasma come conseguenza delle alterazioni piastriniche.

Funzione immunitaria

La protezione dell’organismo da agenti esogeni infettivi o tossici è svolta dagli anticorpi, i fattori del complemento, e il sistema properdinico (fa riferimento a una glicoproteina chiamata properidina o properina, che attiva il sistema del complemento).

Tecniche analitiche per lo studio delle proteine plasmatiche

Elettroforesi delle sieroproteine

L’elettroforesi è la tecniche più utilizzata per lo studio delle sieroproteine. Nell’organismo umano le uniche proteine che sono facilmente disponibili a scopo di studio sono quelle del sangue nonostante costituiscano solo una piccola frazione di tutte le proteine presenti nell’organismo.

L’elettroforesi delle sieroproteine, o anche protidogramma, è una analisi di laboratorio utile per valutare la corretta funzionalità del fegato, la presenza di infiammazioni o infezioni nell’organismo e, addirittura per la diagnosi di malattie più preoccupanti che richiedono ulteriori approfondimenti come il “mieloma multiplo”, o “plasmacitoma”, una neoplasia maligna del sangue. Questa tecnica è basata sulla diversa velocità di migrazione di molecole cariche (in questo caso delle proteine plasmatiche) quando sottoposte a un campo elettrico. Il campione (e quindi le proteine) vengono fatti correre su carta o su foglio di acetato di cellulosa. Si ottengono, su uno dei due substrati, tipicamente cinque bande corrispondenti ai 5 gruppi delle proteine plasmatiche: albumine, alpha-1-globuline, alpha-2-globuline, beta-globuline, gamma-globuline.

Le proteine migrano dal catodo (polo negativo) verso l’anodo (polo positivo). Questo accade perché, quando le proteine sono poste in un ambiente basico (l’ambiente basico è dato dalla soluzione salina in cui viene immerso il foglio di acetato di cellulosa), esse si comportano da acidi: cioè, il gruppo COOH dei vari aminoacidi, che costituiscono la struttura della macromolecola, si dissocia in COO^- e H⁺. Le proteine si caricano, quindi, negativamente e la loro mobilità elettroforetica va dal polo negativo verso quello positivo.