2. Tecniche per lo studio delle proteine plasmatiche (elettroforesi delle sieroproteine, metodo di kjeldhal, metodo del biureto, metodo di folin-lowry, metodo di bradford) + descrizione delle più importanti proteine plasmatiche

Il metodo di Folin-Lowry per la determinazione delle proteine plasmatiche

Questo metodo può essere suddiviso in due parti: una prima parte è identica alla reazione del biureto, cioè le proteine del plasma reagiscono in ambiente basico (determinato dalla presenza di idrossido di sodio) con gli ioni rame forniti dal solfato di rame (o detto anche solfatorameico). Si formano quindi dei complessi proteina-rame.

La seconda parte del metodo di Folin-Lowry prevede l'aggiunta del reattivo di Folin-Ciocalteau, costituito da acido fosfotungstico e acido fosfomolibdico. I complessi rame-proteine riducono l'acido fosfotungstico a blu di tungsteno e l'acido fosfomolibdico a blu di molibdeno.

Poiché la presenza e quantità dei residui aromatici (in particolare quelli tirosinici), ad esempio i fenoli, influenzano fortemente lo sviluppo della colorazione blu, sembra più probabile che gli ioni rameici Cu2+, forniti dal solfato di rame, e che formano complessi con le proteine.

Vengano ridotti a ioni rameosi Cu da parte dei residui aromatici. Saranno poi gli ioni rameosi a interagire con il reattivo di Folin-Ciocalteau (riducendo l'acido fosfotungstico e l'acido fosfomolibdico), sviluppando la colorazione blu. L'intensità di questo colore viene misurato con lo spettrofotometro a 750 nm. L'assorbanza sarà direttamente proporzionale alla concentrazione delle proteine totali del plasma.

Un ultimo metodo chimico per rilevare la quantità totale delle proteine plasmatiche prevede l'utilizzo di coloranti specifici per le proteine. Si tratta più specificamente del DI BRADFORD METODO. Questo metodo utilizza un reattivo, il Coomassie Brilliant Blue, che legandosi ai gruppi amminici e carbossilici, in particolare all'arginina, conferisce una colorazione blu alla soluzione in base alla concentrazione delle proteine in essa contenute. Il picco di assorbanza del colorante è a 595 nm.

Oltre ai metodi chimici

Esistono anche dei metodi fisici per la determinazione della quantità totale delle proteine plasmatiche. Uno di questi fa leva sulla capacità di alcuni aminoacidi, in particolar modo tirosina, triptofano e fenilalanina, di assorbire luce a 280 nm. Questo metodo è, però, poco specifico dal momento che anche altre sostanze o molecole, ad esempio l'acqua, assorbono luce alla stessa lunghezza d'onda o anche gli acidi nucleici assorbono luce nella cosiddetta regione aromatica, cioè a una lunghezza d'onda compresa tra 250 nm e 290 nm.

L'albumina è una proteina del plasma, prodotta dalle cellule epatiche (l'adulto sintetizza circa 14 grammi di albumina al giorno). È contenuta anche nel latte e nell'albume dell'uovo, da cui prende il nome. L'albumina è essenziale per il mantenimento della pressione oncotica (vedi prima); è importante da un punto di vista nutritivo (vedi prima); inoltre,

essere eliminata viene trasportata dal sangue al fegato legata all'albumina. Una volta nel fegato, la bilirubina viene coniugata con l'acido glucuronico per renderla solubile in acqua e facilitarne l'escrezione attraverso la bile. La bilirubina coniugata viene quindi eliminata dall'organismo attraverso le feci. L'alterazione dei livelli di bilirubina nel sangue può essere indicativa di problemi epatici o di altre condizioni come l'ittero. L'ittero si manifesta con una colorazione giallastra della pelle e degli occhi a causa dell'eccesso di bilirubina nel sangue. In conclusione, l'albumina e la bilirubina sono due sostanze importanti per il corretto funzionamento del fegato e dei reni. La loro presenza o alterazione nei fluidi corporei può essere indicativa di problemi di salute.espulsa dovrà essere solubilizzata in acqua. Quindi la bilirubina viene trasportata dall'albumina fino al fegato utilizzando il circolo sanguigno e nel fegato viene convogliata nella bile. Nell'elettroforesi la banda dell'albumina alcune volte appare suddivisa in due frazioni distinte (BISALBUMINEMIA), una situazione riconducibile su base genetica. ANTITRIPSINA -> α-1E' una glicoproteina, prodotta dal fegato che inibisce le proteasi e le elastasi, enzimi contenuti nei neutrofili che degradano le strutture proteiche. I processi infiammatori, le infezioni, i traumi, le ustioni, le necrosi estese di tessuti, alcune forme di tumore (epatoma) provocano un aumento della sintesi di α1-antitripsina epatico. Alla PCR, alla ceruloplasmina, appartiene alle proteine della fase acuta, cioè proteine che aumentano in caso di infiammazione. Un ruolo importante è quello di regolare l'attività dell'elastasi neutrofila, una

proteasi coinvolta nella degradazione del tessuto connettivo, particolarmente quella del polmone, che viene liberata nel corso di processi micro-infiammatori a livello bronchiolo-alveolare. Il deficit genetico provoca enfisema polmonare, in quanto viene meno la protezione nei confronti di enzimi che danneggiano in modo irreversibile gli alveoli polmonari. Come terapia, l'AT viene utilizzata per trattare individui che mancano di tale proteina.

APTOGLOBIN

L'aptoglobina è una glicoproteina di trasporto, la cui funzione consiste nel legare in maniera irreversibile le molecole di emoglobina libera che circolano nel sangue. L'emoglobina è libera nel sangue quando avvengono dei processi (non fisiologici) di emolisi intravascolare. Questo evento può verificarsi conseguentemente a malaria, oppure l'emolisi può essere scatenata dall'assunzione di farmaci, o anche se i dispositivi valvolari cardiaci non funzionano bene ecc. Nel caso, quindi, si

dovrai consultare un medico in quanto potrebbe essere indicativo di un problema di salute.

Si parla di emoglobinuria, che non deve essere confusa con l'ematuria, condizione secondo la quale è il sangue a presentarsi nelle urine e non solo l'emoglobina. Se l'emoglobina entra a far parte del filtrato glomerulare, il complesso aptoglobina-emoglobina riesce a sfuggire ai glomeruli. Essendo sintetizzata dal fegato, l'aptoglobina plasmatica diminuisce nelle persone con malattie epatiche (epatiti, cirrosi, neoplasie ecc.). Aptoglobina alta si apprezza in tutte le condizioni infiammatorie e infettive.

CERULOPLASMINA

La ceruloplasmina è la principale proteina di trasporto del rame nel sangue. Essa lega fino a 8 atomi di rame per molecola. In minima parte si trova legata anche all'albumina e agli amminoacidi. Sintetizzata principalmente dal fegato, la ceruloplasmina ridistribuisce il rame epatico ai tessuti. Inoltre, la ceruloplasmina è molto importante per ossidare lo ione ferrico (Fe3+) a ione ferroso (Fe2+). Il ferro entra a far parte del

gruppo eme in forma di ione ferrico, ma quando deve legare la transferrina, per essere riportato dal fegato al midollo osseo, deve trovarsi in forma di ione ferroso. Ed è per questo che interviene la ceruloplasmina. Aumenta in gravidanza, in seguito all'assunzione di anticoncezionali, nelle infezioni acute, nelle neoplasie e in ogni tipo di flogosi, infatti è una proteina della fase acuta. Diminuisce fortemente nella Malattia di Wilson, caratterizzata da alterazioni del metabolismo del rame con deposito del rame nel fegato (epatite e cirrosi cronica), nel cervello (lesioni neurologiche e psichiatriche), nella cornea, nel rene. METODO DI RAVIN La ceruloplasmina può essere dosata con il metodo di Ravin. Secondo questo metodo, il campione viene miscelato con la p-fenilendiammina. La ceruloplasmina catalizza la reazione secondo cui l'ossigeno, presente nell'aria, ossida la p-fenilendiammina causando un suo cambiamento di colore. L'intensità di questo colore,

misurata con uno spettrofotometro a 535 nm, è direttamente proporzionale all'attività enzimatica della ceruloplasmina. Dato che anche il ferro o il rame a cui laceruloplasina è legata possono mettere in atto questa reazione, è necessario correggere il risultato, preparando un bianco in cui l'azione della ceruloplasmina viene bloccata dall'azoturo di sodio (NaN ).

3-MACROGLOBULINA -> α 2E' fra le più grosse proteine plasmatiche. Svolge diversi compiti fisiologici: è un inibitore specifico delle proteasi plasmatiche (trombina, plasmina) formando dei complessi e inibendo in tal modo l'attività di questi enzimi, quindi contribuisce all'omeostasi e all'equilibrio dei processi coagulativo e fibrinolitico; trasporta alcuni ormoni polipeptidici come il somatotropo e l'insulina. Aumenta nei diabetici, nei cirrotici, nelle dermatiti ecc.; diminuisce in seguito ad assunzione di

farmacifibrinolitici.

Ciascun individuo possiede un enorme repertorio di anticorpi differenti che fungono da sistema di difesa contro gli innumerevoli antigeni esterni. Se un corpo estraneo, quale un patogeno, riesce a superare i meccanismi di difesa dell'immunità innata viene chiamata in causa l'immunità adattativa (o acquisita). Nell'ambito di questo sistema possiamo distinguere due tipi di risposte: una risposta detta cellulo-mediata (o cellulare) e una risposta detta umorale. Nella risposta cellulare intervengono i linfociti T; nella risposta umorale, invece, intervengono i linfociti B. Nel caso dei linfociti B, questi riconoscono l'antigene grazie al legame tra questi e le immunoglobuline (Ig o anticorpi) che vengono prodotti dai linfociti B stessi. Gli anticorpi sono sempre costituiti da quattro catene polipeptidiche. Due di queste catene, uguali nella loro sequenza amminoacidica, sono chiamate catene leggere o catene L; le restanti due,

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