Proteine Plasmatiche

Metodi qualitativi e quantitativi per la determinazione delle proteine

Metodi qualitativi:

• Elettroforesi
• Immunoelettroforesi
• Elettroforesi bidimensionale
• Tecniche immunochimiche

Metodi quantitativi:

• Determinazione delle proteine totali

Le proteine del plasma sono composte dalle proteine del siero e dal 3-5% di fibrinogeno. Le proteine del siero sono costituite per il 60% da albumina e per il 40% da globuline.

Elettroforesi delle sieroproteine

L'elettroforesi su acetato di cellulosa delle proteine del siero permette di separare le proteine in 5 bande, corrispondenti ad altrettante frazioni proteiche. Ogni banda comprende numerose proteine, ad eccezione dell'albumina, che hanno una mobilità elettroforetica simile.

Le bande, secondo un ordine di velocità di migrazione anodica decrescente, sono:

1. Albumina α2
2. 1α
3. 2
4. ζγ

Tecnica dell'elettroforesi delle sieroproteine

L'elettroforesi è un metodo per separare molecole cariche in base alla loro mobilità in un campo elettrico. La fase solida utilizzata può essere agarosio o acetato di cellulosa, mentre la fase mobile è una soluzione ionica a pH 8.6.

applicato il campo elettrico

Molecole con carica netta positiva → catodo (-)

Molecole con carica netta negativa → anodo (+)

Mobilità elettroforetica dipende da:

• Intensità del campo elettrico
• Carica della proteina (struttura amminoacidica, presenza di gruppi carichi)
• pH della soluzione salina
• punto isoelettrico della proteina (pH al quale la somma delle cariche positive e negative della molecola è = 0)

pH < P.I. = la proteina è carica + migrazione verso il catodo, migrazione verso l’anodo

pH > P.I. = la proteina è carica -

ELETTROFORESI DELLE SIEROPROTEINES

supporto solido: acetato di cellulosa/gel d’agarosio, pH 8,6.

In queste condizioni tutte le proteine migrano verso l’anodo.

L’EF su acetato di cellulosa mette in evidenza, dopo opportune colorazioni (rosso Ponceau, nero d’amido…), 5 bande corrispondenti ad altrettante frazioni proteiche.

Tali bande, secondo un ordine decrescente di velocità di migrazione,

Sono indicate come: Banda Componenti principali

1. A Albumina
2. α1 antitripsina
3. α2 macroglobulina, aptoglobina
4. β transferrina, C3
5. γ immunoglobuline

Con particolari accorgimenti questo tipo di EF può evidenziare 7 bande: una sottile banda prealbuminica e lo sdoppiamento della banda β in β1 e β2.

ELETTROFORESI DELLE SIEROPROTEINE "scansione densitometrica"

In seguito a della striscia elettroforetica si ottiene un tracciato, il protidogramma elettroforetico, in cui a ciascuna banda corrisponde un picco la cui intensità e larghezza dipende dalla larghezza della banda e la cui altezza dipende dall'area del colore. In base all'area dei picchi, rapportata al totale del tracciato, si può stabilire la % che ciascuna frazione rappresenta rispetto alle proteine totali.

Albumina 57 - 67%

α1 2.1 - 3.7%

α2 5.2 - 10.1%

β 9.1 - 14.2%

γ – 10.8%

19.5%ß 1 2 l’Mediante opportuni accorgimenti elettroforesi su acetato di cellulosapuò risolvere le proteine sieriche in 7 bande, con la comparsa di unabanda pre-albuminica e lo sdoppiamento della banda ß in ß e ß1 2Albumine- AlbuminaMr 66000, è la proteina plasmatica più abbondante (circa i 2/3 di tutte le proteine).Funzioni:1) pressione colloido-osmotica del plasma (dalla quale dipendono gli scambi diliquidi tra plasma e spazi interstiziali);2) potere tamponante del plasma;3) trasporto:sostanze endogene (es. acidi grassi, bilirubina) ed esogene (es.l’aspirina);farmaci come4) riserva circolante di aminoacidi.- Prealbumina. Proteina con Mr 62000, è così denominata per la sua diversaall’albumina.mobilità elettroforetica rispetto Contribuisce al trasporto in circoloun’emivitadegli ormoni tiroidei; può associarsi alla proteina legante il retinolo. Haparticolarmente breve (12 h).

Globuline

Sono proteine globulari, come del resto le Albumine, dalle quali differiscono per talune proprietà chimico-fisiche (in particolare la solubilità). Oltre a svolgere azioni simili a quelle albumina (anche se in misura meno rilevante data la loro minore concentrazione) le globuline plasmatiche comprendono proteine con funzioni specifiche (immunitaria, emostatica, enzimatica ed antienzimatica, ormonale)

PREALBUMINA (0,15 -0,36 g/L)

Sintesi epatica. Struttura tetramerica PM 62000

Ogni monomero è in grado di legare una molecola di tiroxina.

Lega la proteina legante il retinolo (RBP), la quale a sua volta si complessa con la vitamina A.

Marcatore dello stato nutrizionale (a causa della sua breve emivita -12h).

Reazioni infiammatorie

Denutrizione

Danno epatico

Nefrosi

Gravidanza

ALBUMINA (39-51 g/L)

Sintesi epatica PM 66000 Emivita 17 gg

Rappresenta 2/3 del totale delle plasma proteine, perciò gli abbassamenti dei suoi livelli dovuti a deficit di sintesi o perdite

(nefropatie con perdita di proteine, ascite, enteropatie) provocano gravi squilibri della pressione oncotica intravascolare (edema). Serve da deposito mobile di AA dal fegato, dove è sintetizzata, ad altri tessuti, dove viene rotta in AA liberi che possono essere incorporati in altre proteine.

Trasporta ligandi organici o inorganici (tiroxina, bilirubina, penicillina, cortisolo, estrogeni, acidi grassi liberi, calcio, magnesio, eme)

La misura della forma glicosilata può essere utile come controllo dei diabetici poiché è la componente predominante della glucosamina.

Albumina: funzione osmotica

Regolazione della distribuzione dei liquidi fra sangue e tessuti perché è responsabile dell'80% della pressione oncotica del sangue.

Scambio di fluidi tra capillari e spazio interstiziale:

1. Pressione oncotica del sangue
2. Pressione idrostatica dei capillari
3. Pressione oncotica interstiziale
4. Presisone idrostatica interstiziale

GLOBULINE1

αL' E' un'-antitripsina (AT, 2-4 g/L, PM 60000) è il principale componente delle 1.1inibitore delle proteasi (tripsina ma anche chimotripsina, plasmina, elastasi). Il suol'deficit è associato a cirrosi per incapacità degli epatociti ad immettere nel sangue 1-antitripsina prodotta ed ad enfisema per distruzione del tessuto elastico da parte dicollagenasi, prodotte da leucociti in risposta a stimoli irritativi o infiammatori, noninibite.

αL' -glicoproteina acida (o orosomucoide, 0,5-2 g/L, PM 44000)1 E' "proteineha una funzione biologica poco conosciuta. tra leacuta"della fase quella che aumenta più precocemente (insiemealla proteina C-reattiva)αL' -1 fetoproteina è una glicoproteina sintetizzata dagli epatociti1 E'embrionali. marker di tumori epatici primitivi (epatoma,teratoblastoma) e il suo aumento è correlato al fenomeno di"derepressione genica"

L'1-lipoproteina corrisponde alle HDL.

L'α-macroglobulina è fra le più grandi proteine plasmatiche (PM di 82000). È di origine epatica e la sua concentrazione nel siero è di 2-3 g/dL (le donne hanno livelli più alti in risposta agli estrogeni). Possiede un potere inibitorio non specifico nei confronti di enzimi proteolitici (trombina e plasmina), contribuendo all'equilibrio dei processi coagulativo e fibrinolitico. Ha anche funzione di trasporto per alcuni ormoni polipeptidici come il somatotropo e l'insulina. Marker di decorso della sindrome nefrosica.

L'aptoglobina (PM 100000) è di origine epatica e ha una concentrazione nel siero di 50-300 mg/dL. Presenta molte varianti geniche. Il suo ruolo biologico è legato al catabolismo dell'emoglobina (Hb). Si lega immediatamente all'emoglobina che si libera dalla quota di emazie fisiologicamente distrutte per veicolarla ai...

dell'antigene promuoverne eliminazione o di facilitarne le neutralizzazione. Il riconoscimento avviene per un meccanismo di complementarietà spaziale che si realizza fra determinante antigenico e sito combinatorio. La risposta anticorpale è caratterizzata, normalmente dall'intervento di cloni cellulari diversi che sintetizzano Ig non del tutto omogenee con gradi di affinità differenti verso l'antigene (anticorpi policlonali). Gli aumenti ge