Patologia clinica - proteine plasmatiche

ELETTROFORESI DELLE PROTEINE DEL SIERO

L’esame si utilizza per separare le proteine del siero nelle sei

frazioni principali.

La metodica usata è l’elettroforesi su gel di agarosio

tamponato in mezzo alcalino (pH 8.5); le proteine separate

sono colorate con amidoschwarz.

La sensibilità rilevata del metodo è compresa per proteina

monoclonale fra 0,40 e 0,20 g/l.

I kits Hydragel 1-β

2 sono utilizzati sul sistema Hydrasys

β

Sebia semiautomatico con densitometro/scanner a piano fisso

e programma di gestione Phoresis su computer dedicato.

Per l’analisi sono raccomandati campioni freschi.

I sieri devono essere prelevati seguendo le procedure

convenzionali per i test clinici di laboratorio.

I sieri vanno refrigerati (2-8 °C) e si possono conservare

fino ad una settimana.

Se necessitano periodi di conservazione più lunghi

mantenere i campioni congelati (fino ad un mese).

CAMPIONI DA EVITARE:

- Non utilizzare campioni di siero emolizzati

- L'emolisi causa un aumento delle zone alfa-2 e beta.

- Evitare campioni di plasma

- Evitare campioni vecchi o mal conservati o francamente lipemici

VARAZIONI RELATIVE AD ERRONEO

CAMPIONAMENTO

Si possono verificare falsi aumenti di globuline per

β

migrazione di plasma, anziché di siero: il fibrinogeno

(presente nel plasma anche in concentrazioni pari a 500-600

mg/dl) migra tutto in zona 2 causando un aumento

β

proporzionalmente rilevante, ma non patologico, di queste

proteine.

Situazione simile si ha anche con la migrazione di campioni

sierici emolizzati o lipemici: sia l’emoglobina, sia le

lipoproteine vanno infatti a posizionarsi tutte in zona β

causandone un aumento più o meno importante.

VARIAZIONI RELATIVE AD ERRONEO

CAMPIONAMENTO

Si possono verificare falsi aumenti di globuline per

β

migrazione di plasma, anziché di siero: il fibrinogeno

(presente nel plasma anche in concentrazioni pari a 500-600

mg/dl) migra tutto in zona 2 causando un aumento

β

proporzionalmente rilevante, ma non patologico, di queste

proteine.

Situazione simile si ha anche con la migrazione di campioni

sierici emolizzati o lipemici: sia l’emoglobina, sia le

lipoproteine vanno infatti a posizionarsi tutte in zona β

causandone un aumento più o meno importante.

Caratterizzazione delle

Proteine Plasmatiche

PRECIPITAZIONE FRAZIONATA

Le proteine hanno diversa solubilità in acqua o in altri solventi,

per cui possono essere separate dalla soluzione per mezzo di una

precipitazione frazionata.

Le proteine possono precipitare per effetto di agenti

denaturanti: calore, acidi forti (perclorico, tricloroacetico, sali

di metalli pesanti). Vengono quindi separate dagli altri composti

presenti nella soluzione per filtrazione o per centrifugazione.

PROTEINE PLASMATICHE

Valori ematici normali

Proteine totali: 6 - 8 g/dl

Rapporto Albumine/Globuline:

1,2 - 2,20 DIAFANIZZAZIONE

Utilizzo di membrane di acetato di cellulosa

SCANSIONE FOTODENSITOMETRICA

I tracciati vengono letti mediante :

trasforma le differenze di intensità in un grafico con picchi di base e altezza

variabili secondo l’ampiezza e l’intensità della zona separata e colorata

(quantificazione qualitativa-semiquantitativa) Evidenzia solo variazioni

In un siero normale i valori espressi in

percentuale delle frazioni proteiche qualitative delle proteine del

(elettroforesi a 5 zone) sono: siero.

albumina 55-65% Intensità del picco non

2-5%

α1 corrisponde alla quantità delle

7-11%

α2 proteine perché ogni colorante

9-13%

β possiede affinità diversa per le

14-20%

γ diverse proteine

La proteina che principalmente

Si preferisce contribuisce ad una data

l’ispezione visiva frazione non è la sola che migra

(qualitativa) delle in quella zona, ad eccezione

strisce dell’albumina, che può essere

considerata unica.

Ricevuti i Referto con indicazione

Referto generico di dati, si qualitativa e quantitativa

“tracciato procede alla (aumento o diminuzione)

elettroforetico nella loro delle frazioni proteiche

norma” refertazione alterate

PREALBUMINA

PREALBUMINA o TRANSTIRETINA: E’ la frazione più

veloce. Chiamata così perché migra davanti all’albumina. E’

visibile come tenue banda sul tracciato non d i a f a n i z z a t o . L a

sua individuazione costituisce un controllo tecnico di buona

separazione elettroforetica.

• La sintesi avviene principalmente nel fegato e in parte

anche nella retina ed in altri tessuti. E’ il vettore sia per la

tiroxina che per la proteina legante il retinolo. La

concentrazione serica diminuisce moto nei casi di deficit

nutrizionali proteici, nelle lesioni delle cellule epatiche, nel

diabete. E’ una proteina negativa della fase acuta.

•(10 - 40 mg/dl)

ALBUMINA

Banda più stretta, intensa ed omogenea. Proteina di

massa molecolare di 66,5 kDa, a singola catena

polipeptidica. La molecola è ellissoidale asimmetrica;

stabilizzata da 17 ponti disolfuro. Il gene (specifico

delle cellule del fegato) si trova sul cromosoma 4. E’

sintetizzata come molecola più lunga di 24 aa,

costituenti un peptide segnale che viene rimosso per via

enzimatica prima della secrezione della proteina nel

plasma. Il dosaggio dell’albumina è un ottimo indice

della funzionalità epatica.

(3,5 - 5 g/dl)

proteina di trasporto

E’ una (bassa specificità ed affinità ed amplissima

capacità di trasporto per farmaci, bilirubina, acidi grassi, metalli ed

ormoni). La concentrazione plasmatica dell’albumina diminuisce nei processi

infiammatori. Nella corsa elettroforetica, la frazione albuminica appare

come singola banda. L’identificazione delle varianti genetiche dell’albumina

bisalbuminemia

è visibile per la presenza di due bande ( ), una con la

stessa mobilità dell’albumina normale, l’altra con mobilità anodica

(variante fast) o più catodica (variante slow) negli stati eterozigoti. Al

densitogramma la bisalbuminemia appare come un picco bicuspidato.

ipalbuminemia

Condizioni di si osservano in caso di

infiammazioni acute. analbuminemia

Condizione molto rara è l’ , in cui

scompare o è appena visibile la banda dell’albumina (5

mg/dl). La causa del deficit è la diminuita sintesi di

albumina. Talvolta si tratta di normale albumina; altre

volte vengono sintetizzate forme inattivate della

proteina.

L’iperlbuminemia è rarissima.

Anche quando si ha un aumento

nella sintesi di albumina, non si ha

infatti un aumento dei suoi livelli

ematici. Si ha un incremento solo

nei casi di disidratazione.

BANDA 1

α

1-ANTITRIPSINA: (200-300 mg/dl) glicoproteina.

α

Sintetizzata nel fegato come forma immatura (propeptide),

contenente una sequenza segnale che viene rimossa prima

dell’emissione in circolo, dove costituisce la maggiore componente

delle proteasi circolanti. E’ sintetizzata dagli epatociti, dai

macrofagi ma anche in altri tessuti (rene, pancreas, stomaco,

intestino, milza, surrene). Tale proteina agisce come inibitore

della tripsina pancreatica, chimotripsina, trombina, proteina C

attivata, fattori XI e XIII.

l’elastasi

Inibisce prodotta dai neutrofili durante i processi

infiammatori acuti (riduzione demolizione del tessuto) ,soprattutto

a livello polmonare.

BANDA 1

α

1-ANTICHIMOTRIPSINA: glicoproteina.

α

Inibisce la chimotripsina pancreatica. Protegge

l’organismo dai processi infiammatori (polmoni e bronchi)

e dai danni tessutali, modula la risposta immune

proteggendo da reazioni allergiche.

BANDA 2

α

-MACROGLOBULINA: 200-350 mg/dl

( )

α

2

glicoproteina. Sintetizzata dal fegato. Inibitore di proteasi, ma

aspecifico. Agisce solamente nel sangue e non nei tessuti a

causa delle sue grosse dimensioni. Modulatore dell’attività delle

citochine. Aumenta fisiologicamente nel 3° t r i m e s t r e d e l l a

gravidanza, nell’infanzia e nell’età avanzata. Aumenti patologici

si hanno nell’infiammazione acuta, nelle epatopatie, nel diabete.

BANDA 2

α

APTOGLOBINA: 50-300 mg/dl

( ), glicoproteina. Lega

l’emoglobina libera (in modo forte ed irreversibile) nel plasma

dell’uomo e di altre specie animali. Ogni molecola di aptoglobina

lega due molecole di ossiemoglobina. La sua concentrazione

aumenta dalla nascita fino all’età adulta. Diminuisce per

iperconsumo in tutti i casi di emolisi intravascolare e per difetto

di sintesi in condizione di riduzione del numero di epatociti. Può

diminuire anche in seguito a sport prolungati, che comportano

distruzione di eritrociti. E’ una proteina della fase acuta.

ANTITROMBINA 3: (20-40 mg/dl) neutralizza l’azione

della trombina e di fattori della coagulazione in sinergismo con

l’eparina. BANDA 2

α

CERULOPLASMINA: (23-43 mg/dl) glicoproteina.

Maggiore proteina di trasporto plasmatico del rame. La sua

sintesi avviene nel fegato, ma la regolazione della sintesi è

indipendente dalla quantità di rame in circolo. Ogni molecola

si lega a 6 atomi di rame. La ceruloplasmina trasporta il rame,

normalmente conservato nel fegato, ai tessuti periferici, dove

viene utilizzato per la sintesi di numerosi enzimi. Diminuzione

dei livelli di ceruloplasmina si osservano nel morbo di Wilson,

caratterizzato da elevati depositi tossici di rame nel fegato,

cervello, cuore.

PROTEINA TRASPORTATRICE DELLA VITAMINA

D: non si conosce bene la sua funzione specifica, me è la maggior

proteina trasportatrice della vitamina D e dei suoi metaboliti.

Sintetizzata del fegato.

BANDA 1

β

TRANSFERRINA: (nel plasma 200-400 mg/dl)

glicoproteina. Lega e trasporta in modo reversibile lo ione

ferrico. Costituisce la maggiore proteina plasmatica legante il

ferro La sua concentrazione presenta variazioni circadiane e

infradiane. Aumenta nelle sideropenie e diminuisce negli

accumuli di ferro. Le funzioni principali della transferrina

sono: - trasporto di ferro assorbito dall’intestino alle

cellule che lo richiedono

- fattore protettivo contro cellule batteriche e

neoplastiche in quanto compete con esse per l’utilizzo di

ferro. BANDA 2

β

C3: (80-100 mg/100 ml) proteina della fase acuta che si

eleva molto lentamente e richiede 2-10 giorni per raggiungere il

massimo livello dopo un’infiammazione. E’ la proteina del

complemento p