Tecnica immunoistochimica

LA COLORAZIONE IMMUNO-ISTOCHIMICA

Non è ultima per importanza, forse si può dire che è una delle colorazioni più importanti di cui adesso un laboratorio

di anatomia patologica non può prescindere.

La tecnica immunoistochimica consiste in una reazione antigene-anticorpo su una fetta di tessuto. Non andiamo a

ricercare la presenza di antigeni nel corpo umano attraverso un prelievo di sangue (come gli antigeni virali per le

epatiti), qui la valutazione degli antigeni si fa sul tessuto attraverso una reazione dove l’antigene è quello che si trova

sul tessuto e l’anticorpo, diretto contro quell’antigene, è fornito dall’esterno e va ad incubare la sezione di tessuto. È

una reazione immunitaria/immunologica.

DALLE SLIDE:

L’antigene è qualsiasi molecola proteica, lipoproteica o

glicoproteica, in grado di evocare una risposta immunitaria

specifica.

Riconoscimento di un determinato antigene presente in una

cellula o in un tessuto mediante l’utilizzo di un anticorpo

specifico (=anticorpo monoclonale), sfruttando il principio delle

reazioni immunologiche.

L’IHC (reazione immunoistochimica) sfrutta la reazione

antigene-anticorpo per ottenere informazioni circa la presenza

nella cellula o nel tessuto di una specifica molecola (target),

purché questa si possa comportare da antigene = i marcatori

→

I MARCATORI Sono quella sostanza di natura antigenica di cui noi dobbiamo andare a verificare la presenza

all’interno o all’esterno della cellula. Li troviamo ad indirizzo diagnostico, prognostico e predittivo:

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MARCATORI DIAGNOSTICI ci aiutano per fare la diagnosi della malattia.

Ci sono delle situazioni in cui risulta difficile fare diagnosi perché posso confondermi con altre malattie perché la

lesione si presenta con dei caratteri comuni ad altre malattie, un esempio è il tumore del polmone.

In generale i tumori che originano del tessuto epiteliale sono i carcinomi e ne abbiamo diversi tipi, nel caso specifico

del tumore del polmone: il carcinoma squamoso, legato al fumo sigaretta, e l’adenocarcinoma che deriva dagli epiteli

che formano le ghiandole, quindi origina da cellule ghiandolari epiteliali.

Nel nucleo di queste cellule troviamo un antigene specifico cioè il TTF1, sigla (acronimo) che indica fattore di

trascrizione tiroideo, cioè è prodotto esclusivamente da cellule della tiroide e cellule polmonari. Quando vedo questo

tumore ben differenziato in cui le cellule neoplastiche cercano di creare strutture ghiandolari, faccio il marcatore: se

risulta positivo (colorazione marroncina) dico che è adenocarcinoma del polmone. Se risultasse negativo posso

ipotizzare o un carcinoma squamoso o un adenocarcinoma che è però localizzato in altre sedi (intestino, stomaco,

ecc…). Potrei avere altri dubbi: se c’è la possibilità che questo tumore sia una metastasi, come il carcinoma squamoso

dalla laringe che può metastatizzare: in questo caso il marcatore del carcinoma squamoso p63 non mi aiuta a capire

se è un carcinoma primitivo del polmone o è una metastasi da carcinoma.

Riassunto: il marcatore diagnostico è quella sostanza

antigenica che mi indirizza a una diagnosi. Esistono dei

marcatori specifici quali, nel caso nel polmone, il TTF1

che lo ritroviamo nelle cellule degli epiteli ghiandolari

(positivo nell’adenocarcinoma del polmone o della

tiroide) e p63 (positivo nel carcinoma squamoso).

Altri marcatori diagnostici: I linfociti sono un tipo di globulo bianco del sistema immunitario che hanno un ruolo

fondamentale nella difesa contro le infezioni. Li troviamo nei linfonodi che sono delle strutture del sistema linfatico

(localizzati principalmente a livello del collo, delle ascelle e dell’inguine) e il loro compito è quello di attivare la

risposta immunitaria.

I linfomi sono tumori che prendono origine dai linfociti e si ritrovano soprattutto nei linfonodi ma anche in altri

organi (milza, stomaco ecc…). Quando un linfoma coinvolge anche il midollo si parla di leucemia: malattia neoplastica

che riguarda le cellule del sangue dislocate a livello del midollo osseo.

Esistono 3 tipi di linfociti: B, T e natural killer; non li distinguo morfologicamente ma con le colorazioni

immunoistochimiche che esprimono diversi antigeni, nel processo di trasformazione dei linfociti B (si trasformeranno

in plasma-cellule che producono nuovi anticorpi) subisce una differenziazione, matura ed esprime antigeni diversi dai

linfociti T.

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H&E i linfociti B formano i follicoli linfatici dove:

- la parte più chiara al centro sono linfociti maturi e prende il

nome di centro germinativo;

- i linfociti T definiscono invece le aree parafollicolari (corona

attorno al centro germinativo) ed esprimono altri antigeni.

CD20: il marcatore mostra i linfociti B;

BCL2: colora prevalentemente il centro germinativo e poco le aree

parafollicolari;

CD10: colora soltanto il centro germinativo identificando quindi i

linfociti B maturi;

CD3: colora principalmente le aree parafollicolari quindi troviamo i linfociti T.

Quindi a seconda dell'antigene che ho utilizzato posso sapere di fronte a quale linfocita mi trovo (B o T), e prendendo

l’antigene capisco in quale fase di differenziazione si trova il linfocita.

Qual è l’importanza? I linfomi ora vengono quindi descritti meglio caratterizzandoli (es. linfoma della classe B

appartenente al centro germinativo), identificando la diversa aggressività, curandoli non in senso generale (prima

solo radioterapia) ma con farmaci mirati per le cellule che hanno dato la neoplasia.

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MARCATORI PROGNOSTICI ci aiutano a capire come evolverà

la malattia, se la prognosi è buona o infausta. Un esempio tra i

più importanti è il Ki67, un marcatore nucleare (si trova nel

nucleo) che va a colorare le cellule che si trovano in una fase di

proliferazione (replicazione). Se vediamo un tumore che ha un

maggior numero di cellule marcate per il Ki67 (colorazione in

marroncino), vuol dire che è più aggressivo perché ha un alto

indice di proliferazione. →

MARCATORI PREDITTIVI mi dice come la malattia risponderà

ad una terapia farmacologica, perché i marcatori in questione

(di natura proteica) vanno a segnalare delle proteine, che

possono essere prodotte dalla cellula in modo alterato, e che

sono il segno quindi di un alterazione a livello dei geni (del

DNA).

Quindi: i prodotti genici sono delle proteine che identifichiamo

con i marcatori presenti o nel nucleo, o nel citoplasma o a livello

della membrana cellulare. I marcatori sono predittivi perché ci

danno informazioni sul tipo di terapia che il paziente potrà fare

e come risponderà alla terapia.

Ad esempio per il tumore del polmone quando si faceva la diagnosi, 15 anni fa, si suddividevano se a piccole cellule o

non a piccole cellule, rifacendosi alle cellule che componevano il tumore. Ma hanno un andamento, una terapia e una

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prognosi diverse.

- Le piccole cellule rappresentavano un tumore molto aggressivo, inoperabile e che si presenta quando ha già dato

metastasi (muori in 1 anno dalla diagnosi infausta) ed è nodulabile, quindi l’unica terapia che si può fare è la

chemioterapia a cui risponde bene inizialmente finché non diventa resistente e non si può fare più nulla.

- Quando i tumori si presentavano non a piccole cellule, potevano essere sia un adenocarcinoma sia un carcinoma

squamoso, ma non interessava la differenza tra questi due perché si effettuava una terapia uguale per entrambi

(chemioterapia), ed erano operabili a seconda della grandezza.

Ad oggi non è più possibile fare la differenza tra piccole o grandi cellule, ma distinguiamo tra carcinoma e

adenocarcinoma perché per quest’ultimo bisogna fare la valutazione dei geni: possono essere mutati o inespressi, e

questo porta a fare una terapia differente, specifica perché andiamo ad agire sulle cellule neoplastiche bloccandone

la crescita, e mirata, risultando una terapia non sono tossica come la chemio.

Il gene dell’adenocarcinoma del polmone è ALK e può essere mutato nel 2% dei tumori, sembra poco ma su 200

pazienti si possono valutare mutazioni sottilissime per le terapie.

a

1 tecnica: valuto il prodotto genico attraverso una reazione immunoistochimica (antigene-anticorpo), se risulta

positiva vedo delle colorazioni citoplasmatiche, quindi il gene ha subito un’alterazione.

a

2 tecnica: nel caso di dubbio diagnostico si procede con l'indagine molecolare dove vado a vedere il gene attraverso

delle tecniche di ibridazione in situ, anche se adesso ci sono delle tecniche di sequenziamento genico (NGS) dove

vedo una sequenza di 400/500 geni che possono essere alterati o meno.

Un altro esempio può essere il tumore della

mammella dove si va a fare il marcatore predittivo

HER2, una proteina già presente nella mammella che

interviene nella proliferazione cellulare: quando c’è

bisogno di un ricambio cellulare, il gene si attiva e

produce la proteina di membrana, che funge da

recettore legandosi al ligando, attiva dei segnali interni

al nucleo che produrrà le proteine che daranno

l’impulso della produzione cellulare. Tutto questo è un

meccanismo controllato e regolato, ma nella neoplasia

il meccanismo è disorganizzato perché il gene è alterato e amplificato, producendo molte copie della proteina HER2,

questo fa sì che le proteine che si legano con il ligando a livello della membrana cellulare, portano ad avere delle

cellule che sono sempre in fase di replicazione cellulare. Allora una neoplasia della mammella, che esprime questo

recettore, è più aggressiva per alta sintesi cellulare, quindi hanno una maggiore proliferazione e possibilità di

metastatizzare.

Possiamo dire allora che questo fattore HER2 ha una duplice funzione: predittiva e prognostica:

- Prognostica perché ci fa capire subito che è un tumore aggressivo che si può presentare già con metastasi;

- Predittiva perché conoscendo la conformazione del recettore, si è scoperto un farmaco che simula questa

conformazione, va a legarsi alle cellule e le mette a riposo, non si replicano più finché non diventa resistente. Questo

farmaco quindi ha la stessa morfologia ma non la stessa funzione.

In conclusione l’HER2 è un fattore prognosticamente sfavorevole ma predittivamente favorevole.

COME SI EVIDENZIANO QUINDI QUESTI MARCATORI? I marcatori si evidenziano attraverso una colorazione che può

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essere della membrana, del citoplasma o del nucleo.