Report tecnico scientifico di Microbiologia applicata - 6/6 punti

Calcolo delle colonie

X = (n1 * n2) / (V * d)

Dove:

• V = volume che è stato piastrato (0,1 mL)
• n1 = numero di piastre contate per la prima diluizione
• n2 = numero di piastre della seconda diluizione
• d = prima diluizione considerata, ovvero la più concentrata
• 0,1 = fattore di diluizione

I dati ottenuti sono i seguenti:

Svolgendo la formula precedente per entrambi i terreni si ottiene:

X = (5 * 8) / (427 * 0,1) = 498/0,11 = 4,5 * 10^10 (M17) UFC/g

X = (n1 * n2) / (V * d) = (116 * 0) / (0,1 * 0,1) = 116/0,11 = 1,08 * 10^10 (MRS) UFC/g

UFC/g

Attraverso questi dati è possibile stabilire che entrambi i microrganismi presentano una carica di cellule vitali e coltivabili superiore a 10 UFC/g, come previsto dalla legge. Inoltre, è evidente che S. thermophilus mostra una carica superiore di un ordine di grandezza rispetto a L. delbrueckii subsp bulgaricus, dal punto di vista tecnologico.

Mediante questi dati è possibile osservare l’effetto di diluizione tra le piastre M17 da -5 a -6 e MRS da -4 a -5, evidenziato dal fatto che non sono presenti colonie nella piastra -5 di MRS. È importante notare che la morfologia delle colonie sulle piastre dovrebbe essere la stessa, anche se potrebbero verificarsi contaminazioni da altri microrganismi.

Questa differenza è facilmente osservabile anche a occhio nudo, come nella seguente immagine.

Figure 2: M17 e MRS con colonie di diversa morfologia rispetto ai due batteri lattici Bacillus licheni-3.3 Coltura pura di un microrganismo

Introduzione

Nella stessa giornata, è stata svolta anche un'altra esercitazione che consisteva nel piastramento di come nel mio caso, o di B. licheniformis, Pseudomonas putida. Entrambi sono microrganismi ambientali poco esigenti che possono crescere su terreni come il Nutrient agar, che è stato utilizzato come terreno di coltura.

Figure 3: Una piastra di Nutrient agar per il piastramento di B. licheniformis

Per eseguire il piastramento, il microrganismo è stato prelevato da uno slant che lo conteneva e poi distribuito, mediante l'uso dell'ansa, sulla superficie del terreno di coltura all'interno della piastra di Petri. L'obiettivo del piastramento è quello di ottenere colture pure e isolate, che possono essere trasferite su altri terreni di coltura per ulteriori analisi e studi, il terreno è stato poi inoculato a 30°C per 24 ore.

Per ottenere una coltura pura si deve necessariamente partire da una colonia, in quanto

quest’ultima è il prodotto della replicazione di una cellula viva e vitale.

3.3.2 Risultati

Osservando la capsula Petri dopo una settimana, si può osservare la presenza di due aree, in seguito è presente un’immagine per far capire meglio.

• una zona di crescita confluente e diluizione dell’inoculo;
• una zona dove sono presenti delle colonie singole da cui partire per ottenere la coltura pura.

Figure 4: Piastra Petri in seguito ad inoculo ed incubazione di B. licheniformisB. licheni

3.4 Caratterizzazione fenotipica di un isolato ambientale:formis

3.4.1 Introduzione

L’obiettivo della terza attività è quello di valutare la capacità di un determinato microrganismo, in questo caso di crescere su particolari tipologie di terreno, B. licheniformis, grazie alla sua capacità amilasica, proteolitica e catalasica. Per vedere le diverse attività enzimatiche verranno utilizzati terreni dalla composizione particolare, come agar latte e agar amido.

indicati anche nella sezione 3.1.

Dopo aver ottenuto una coltura pura a partire dallo slant di B. licheniformis seguito dell’operazione di striscio, si preleva della biomassa e si effettua nuovamente uno striscio su terreni di agar latte e agar amido per valutare la capacità di crescita del microrganismo in queste condizioni.

B. licheniformis

3.4.2 Crescita di su agar latte e risultati

La piastra con agar latte (AL) viene utilizzata per valutare due elementi:

• la capacità del microrganismo di crescere su AL;
• la sua attività proteolitica nei confronti delle caseine del latte.

Si effettua lo striscio del microrganismo a partire da coltura pura e si incuba a 37°C per circa 24/48 ore in condizioni di aerobiosi.

Dopo una settimana nella stessa piastra si possono notare i seguenti elementi:

• le proteine sono rimaste integre solo sul bordo della piastra, dove non è presente il microrganismo, di conseguenza il bacillo può crescere su questo terreno;
• dalla

Piastra si può osservare che il microrganismo presenta un'attività proteolitica nei confronti delle caseine, lo si può dedurre dal fatto che la piastra di AL, con incubato, presenta una sezione molto limpida rispetto a B. licheniformis alla piastra di partenza. Inoltre l'illimpidimento causato dal bacillo è maggiore di quello causato da P. putida, di conseguenza presenta una maggiore capacità proteolitica.

In seguito è presente l'immagine che lo testimonia.

Figure 5: Agar latte in seguito ad inoculo ed incubazione di B. licheniformis

3.4.3 Crescita di su agar amido e risultati

La piastra con agar amido (AA) viene utilizzata per valutare:

• la capacità del microrganismo di crescere su AA;
• la sua attività amilasica, ossia la loro capacità di degradare amido utilizzando l'enzima amilasi, quindi si può dedurre se il bacillo ha usato l'amilosio come fonte di nutrimento.

Si effettua lo striscio a partire da colonia pura di e, dopo

Aver effettuato B. licheniformis un periodo di incubazione si può osservare che il bacillo cresce su AA, ma non si capisce se presenta un'attività amilasica. Per risolvere questo problema si utilizza un metodo colorimetrico, ovvero attraverso il reagente di Lugol (soluzione di iodio e ioduro di potassio), deponendone all'incirca 500µL sulla piastra stessa. La soluzione contiene iodio ed esso va ad intercalarsi e reagire con l'elica dell'amilosio se presente nel terreno, cambiando il colore in blu. Se il microrganismo avrà invece degradato l'amido, il terreno rimarrà giallo, questa colorazione la si può osservare intorno alle colonie del bacillo, di conseguenza B. licheniformis presenta un'attività amilasi-positiva, come si può osservare nella seguente immagine, a differenza di che è amilasi-negativa.

Figure 6: Agar amido in seguito ad inoculo e incubazione di dopo B. licheniformis, l'aggiunta del reattivo di Lugol B.

putida, più lenta. 13 B. licheniformis3.4.5 Risultati finali sulla caratterizzazione fenotipica diNella seguente tabella sono presenti i dati di tutte le analisi effettuate su B. licheni-il cui scopo è quello di determinare la caratterizzazione fenotipica del bacillo.formis, Table 3: Risultati caratterizzazione fenotipica

B. licheniformis 14 S. thermophilus3.5 Prova di utilizzo degli zuccheri dei batteri lattici:L. delbrueckii subsp bulgaricuse3.5.1 ScopoQuesta attività ha come scopo quello di valutare la capacità di un determinato microorganismo, in questo caso di utilizzare zuccheri (galattosio, lattosio eS. thermophilus,glucosio), attraverso una prova di fermentazione.3.5.2 ProcedimentoPer poter effettuare l'attività bisogna innanzitutto utilizzare l'ansa sterile e prelevaredella biomassa di dalla piastra Petri, e conseguentemente ottenere unaS. thermophilussospensione diluendo la biomassa

• G, ovvero la provetta dove si inserirà il glucosio;
• Ga, per il galattosio;
• L, per il lattosio;
• -, ovvero il tubo dove non si inserirà nessun carboidrato.

Inserisce nessuno zucchero. In seguito stabilire la concentrazione degli zuccheri che si vogliono utilizzare all'interno di ogni singola provetta, attraverso la seguente formula:

C_i * V_i = C_f * V_f

Dove:

• C_i, concentrazione iniziale, è pari al 20% per ogni zucchero;
• V_f, volume finale, ovvero quello in provetta pari a 2mL;
• C_f, concentrazione finale, pari all'1%.

Il parametro mancante è V_i, volume iniziale, e lo si ottiene attraverso la seguente formula:

V_i = (C_f * V_f) / C_i = (1 * 2) / 20 = 0.1mL

Di conseguenza a tre delle quattro provette si aggiungono 100µL.