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NOME DEL TERRENO MICRORGANISMI COLTIVATI

PCA Mesofili totali

VRDB Enterobatteri

KEA Enterococchi

MRS + 10mg/L VANCOMICINA Microrganismi eterofermentanti

M17 Streptococcus thermophilus

MRS pH 5.5 Batteri lattici acidofili

Tabella 3: Terreni utilizzati in Microbiologia Alimentare

• Terreno BSM per prova di fermentazione di Bacillus licheniformis:

- Peptone 15g/L (Merk)

- Estratto di lievito 6g/L (Merk)

- Tween 80 1mL (Merk)

- Rosso di Clorofenolo 0.04 g (Merk)

- Acqua distillata

▪ pH 6.4

▪ sterilizzazione 121°C per 15’

• Soluzione fisiologica

• Bunsen, è uno strumento comunemente utilizzato in microbiologia per

sterilizzare e riscaldare campioni e strumenti di laboratorio. Per utilizzarlo in

modo sicuro ed efficace, è importante seguire alcune precauzioni. Innanzitutto,

è fondamentale regolare l’intensità della fiamma in base alle esigenze

specifiche, distinguendo tra fiamma ossidante e riducente. Inoltre, il Bunsen

deve essere utilizzato sempre in un ambiente ben ventilato e posizionato

lontano da sostanze infiammabili. Seguendo queste indicazioni, è possibile

operare in laboratorio in modo sicuro e ottenere risultati ottimali.

• Vortex, strumento utilizzato in microbiologia per agitare e mescolare campioni

liquidi, come terreni di coltura o soluzioni contenenti microrganismi. Grazie al

movimento circolare e intermittente, il vortex permette una miscelazione

rapida e uniforme dei campioni. Questo processo assicura che i microrganismi

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rimangano in sospensione e garantisce una distribuzione omogenea delle

sostanze nutritive nei terreni di coltura, ottimizzando le condizioni per la

crescita e lo studio dei microrganismi.

• Propipette, uno strumento di misurazione molto preciso che consente di

prelevare e trasferire volumi estremamente ridotti di liquidi. È composta da un

dispositivo di aspirazione manuale e da una punta monouso che si adatta al

volume da misurare. La propipetta è considerata come un dispositivo di

sicurezza

• Pipette sterili, strumento di precisione utilizzato per prelevare e trasferire con

precisione piccole quantità di liquidi. Ne esistono di diversi tipi, ma quelle da

noi utilizzate sono le pipette graduate

• ad “L”,

Spatole strumento molto utile per lo spatolamento di una sospensione

di microrganismi su un terreno di coltura

• Anse, uno strumento di laboratorio utilizzato in microbiologia per prelevare

campioni di microrganismi e trasferirli, ad esempio, in un terreno di coltura

• Provette sterili

• Anaerocult, un prodotto contenente dei catalizzatori che se bagnati permettono

di sequestrare l’ossigeno dall’ambiente: viene utilizzato all’interno di apposite

giare al fine di garantire condizioni di anaerobiosi

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3. Microbiologia Generale

Nel primo laboratorio abbiamo affrontato le basi della microbiologia in laboratorio:

diluizione decimale (di un campione di yogurt), seguita da piastramento. Abbiamo poi

piastrato un microrganismo ambientale per ottenere una coltura pura.

Nel secondo laboratorio si sono analizzate le colonie ottenute nel laboratorio

precedente.

Nel terzo si è proceduto alla caratterizzazione fenotipica di un isolato ambientale ed

per valutare l’utilizzo degli zuccheri,

abbiamo eseguito delle prove di fermentazione

sui microrganismi protecnologici utilizzati nella produzione di yogurt

Nel quarto laboratorio si è monitorato il risultato ottenuto della precedente

esercitazione, ed abbiamo effettuato la colorazione di Gram.

3.1 Valutazione della carica batterica totale di microrganismi protecnologici di

Yogurt intero bianco Sterzing-Vipiteno

3.1.2 Introduzione e scopi

Il primo laboratorio, svolto in data 06/10/2023, aveva come obbiettivo la

determinazione della carica batterica di un campione di yogurt. dell’azienda

Nello specifico il campione a noi fornito era uno yogurt intero Sterzing-

Vipiteno.

Lo yogurt è stato prodotto utilizzando i batteri lattici S. thermophilus e L. delbrueckii

subsp bulgaricus.

L’obiettivo dell’analisi è stato determinare la presenza e la quantità di questi batteri

nel prodotto.

Durante la conservazione, lo yogurt è stato mantenuto a una temperatura di 4°C per

garantire il rispetto della catena del freddo. La data di scadenza è stata fissata per il

09/11/2023.

L’analisi è stata condotta prima di questa data, e secondo le normative vigenti, è

7

10

necessario che lo yogurt contenga almeno UFC/g di S. thermophilus e L.

delbrueckii subsp bulgaricus vivi, vitali e coltivabili.

3.1.2 Procedimento

Per condurre questa analisi è necessario eseguire il piastramento dei batteri

terreno di coltura, a seguito delle diluizioni decimali

sull’adeguato della sospensione

di prodotto.

Andremo a diluire 1 mL del nostro prodotto, sotto bunsen al fine di mantenere la

sterilità, in 9 ml di soluzione fisiologica (per evitare uno stress osmotico alle cellule)

all’interno di una provetta sterile. Questo passaggio permette di ottenere una diluizione

decimale del prodotto e di conseguenza dei microrganismi: dispetto al prodotto iniziale

−1

10

saranno dieci volte meno, chiameremo questa diluizione .

Importante, al fine di ottenere un risultato omogeneo, passare la provetta al vortex.

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Ripetiamo questo passaggio, questa volta però sospendendo 1 mL prelevato dalla

−1 , all’interno di una nuova

10

diluizione provetta sterile, in 9 mL di soluzione

fisiologica.

In questo modo otterremo una nuova diluizione decimale, andando a rendere il numero

−2

10

di microrganismi presenti 10 volte meno, che chiameremo . Procediamo in questo

−6

10

modo fino ad arrivare alla diluzione .

Questa operazione prende il nome di “diluzione decimale” e serve ad ottenere delle

diluzioni, che una volta piastrate permettano una conta delle singole colonie, da cui

poi risalire al numero totale dei microrganismi nel prodotto.

Una volta portato a termine il processo di diluzione, andremo a piastrare 100L per

spatolamento delle diluzioni appena ottenute al fine di poter contare poi le colonie.

Contenendo però più microrganismi, dovremo trovare il modo per andare a isolare una

specie piuttosto che un'altra: per fare ciò considereremo le caratteristiche della singola

specie, e le sfrutteremo per trovare un terreno e/o delle condizioni di incubazione

adatte al loro isolamento.

Nello specifico:

- S. thermophilus: è un batterio anaerobico ma ossigeno tollerante, viene

coltivato su M17 2% Lattosio (2g lattosio/100g) a 37°C per 48h in aerobiosi

- L. delbrueckii subsp. bulgaricus: è un batterio acidofilo, viene coltivato su

MRS pH 5.5 in condizioni di anaerobiosi a 37°C per 48 h.

La fonte di carbonio del terreno è il glucosio e viene acidificato dalla presenza

di acido lattico −4 −5

10 10

Andremo nello specifico a piastrare su terreno MRS pH 5.5 le diluizioni e .

−5 −6

10 10

Piastreremo invece su terreno M17 2% Lattosio le diluizioni e

L’anaerobiosi in incubazione viene garantita grazie al posizionamento delle piastre in

delle giare ermetiche, con al loro interno un catalizzatore (come Anaerocult) che se

bagnato sequestra O e rilascia CO .

2 2

Figura 1 e 2: sviluppo su piastre di M17 2% lattosio delle diverse diluizioni decimali piastrate: si evidenzia la diminuzione

proporzionale delle colonie sviluppate 7

3.2 Preparazione di una coltura pura di Bacillus licheniformis

3.2.1 Introduzione

Durante lo stesso laboratorio è stata svolta un ulteriore esercitazione: il piastramento

di un isolato ambientale al fine di ottenere una coltura pura.

Nel mio baso si trattava di B. licheniformis, un bacillo GRAM + e sporigeno, ma ad

alcuni miei colleghi si è presentato lo stesso compito con Pseudomonas putida.

caratterizzati dall’essere poco esigenti, e che

Essi sono microrganismi ambientali

quindi riescono a crescere anche su terreni come Nutrient agar, che è stato appunto

utilizzato come terreno di coltura.

3.2.2 Procedimento

Al fine di isolare una coltura pura di B. licheniformis, ci è stata fornita una provetta

con all’interno del terreno agarizzato su cui è cresciuto il microrganismo.

L’obbiettivo è appunto andare ad isolare una singola colonia su terreno nutrient agar,

un terreno non selettivo e non differenziale che è progettato per fornire i nutrienti

essenziali alla crescita della maggior parte dei microrganismi.

Tramite l’uso di un’ansa prelevo una piccola porzione della biomassa, che vado a

depositare in piastra per strisciamento (“streak plating”), utilizzando lo strumento

come un pennello.

L’obbiettivo di questa tecnica è di andare ad ottenere una diluzione continua, in modo

da ottenere una singola colonia ben divisa dalle altre alla fine dello striscio.

Incubo poi le piastre a 30°C per 48h in aerobiosi. Streak Plating con evidente

diluizione dell’inoculo

Colonia singola da cui partire

per ottenere la coltura pura

Figura 3: Risultato Streak Plating di Bacillus

licheniformis 8

3.3 Isolamento di una colonia di Streptococcus thermophilus, Lactobacillus

delbrueckii subsp. Bulgaricus e B. licheniformis

3.3.1 Procedimento

Essenzialmente si tratta di un isolamento di una colonia a partire dai 3 terreni che

abbiamo incubato precedentemente, e su cui sono cresciuti i microrganismi.

Andremo quindi a selezionare su M17, MRS pH 5.5 e Nutrient agar quelle colonie che

sono ben separate dalle altre, al fine di evitare il prelievo di più colonie insieme che

potrebbero andare ad influenzare il risultato dell’isolamento.

un’ansa

Quindi, sempre con preleveremo la colonia ed andremo ad effettuare lo

strisciamento sul rispettivo terreno: M17 per isolare una colonia di S. thermophilus,

MRS pH 5.5 per isolare una colonia di L. delbrueckii subsp. bulgaricus e Nutrient

Agar per isolare una nuova colonia di B. licheniformis.

Incubo poi le piastre secondo le condizioni già precedentemente citate.

3.4 Caratterizzazione fenotipica di un isolato di B. licheniformis

3.4.1 Introduzione

caratterizzazione fenotipica si intende l’andare a

Per determinare e analizzare i tratti

morfologici, biochimici, metaboli e fisiologici di un microrganismo, ma anche il

comportamento di quest’ultimo in risposta a vari parametri ambientali.

L’obiettivo della terza fase del nostro studio è valutare la capacità di crescita di B.

licheniformis su terreni specifici, sfruttando le sue attività enzimatiche amilasica,

proteolitica e catalasica.

A tale scopo, utilizzeremo terreni specializzati come agar latte e agar amido.

Dopo aver ottenuto una coltura pura de