Report esercitazioni Contaminazione biotica degli alimenti e degli ambienti

Report del laboratorio di contaminazione biotica

degli alimenti

Monica Vaghi

Matricola 19471A

Scienze e Tecnologie della Ristorazione, A.A 2023-2024

Studentessa del secondo anno

Sommario

Nelle esercitazioni tenute durante il laboratorio di contaminazione abbia-

mo ripercorso il processo di isolamento ed identificazione di alcuni patogeni

responsabili delle malattie post-raccolta.

1 Isolamento del patogeno

Nel primo incontro è stata presa in analisi una derrata portata da casa, nel mio

caso un’arancia, che mostrava, nella parte superiore, la presenza di un fungo oramai

già espanso, visibile ad occhio nudo; all’apice si notava anche una piccola presenza

di micelio aereo, nella fase iniziale di crescita. La zona è di colore verde scuro,

mentre quelle adiacenti presentano invece una colorazione diversa, più schiarita, che

tende a divenire bianca. Al tatto l’area contaminata dal fungo risulta essere poco

consistente, rispetto a quella senza contaminazione. Si suppone che quest’ultima

sia avvenuta perché la derrata era stata lasciata in un luogo molto umido, in cui la

diffusione di muffe era molto presente, favorendo cosı̀ l’attacco al frutto.

Figura 1: Derrata con patogeno

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Fatte queste prime osservazioni, è stato eseguito un prelievo del patogeno pre-

sente sulla derrata alimentare, per poi purificarlo e deporlo in una coltura pura per

poterlo coltivare e conservare. Per il prelievo si è selezionato un campione rappre-

sentativo del patogeno e, per farlo, è stato utilizzato un bisturi, sterilizzato con

la fiamma bunsen, per raschiare una porzione della coltura. Una volta attuato il

prelievo, il campione è stato messo in eppendorf con all’interno acqua sterile; una

volta disciolto, abbiamo ottenuto una soluzione con acqua e patogeno. La soluzione

è stata poi trasferita su delle piastre con due tipi di terreno differenti:

• MA+T = malt agar + tetraciclina; il malto è un componente fondamentale,

ricco di nutrienti, mentre l’agar aiuta a solidificare il terreno. In questo modo

è possibile una crescita maggiore del patogeno, che trova cosı̀ un ambiente

favorevole al suo sviluppo.

• WA+T = water agar + tetraciclina; in questo terreno, invece, la crescita del

patogeno sarà più lenta, ciò dovuto a una minore concentrazione di nutrienti.

La crescita lenta, però, favorisce una visione migliore delle ife.

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2 Identificazione morfologica dei funghi patogeni

2.1 Analisi macroscopica

Passata una settimana dal primo isolamento in coltura pura, abbiamo potuto osser-

vare le due piastre, con i due diversi terreni, utilizzate precedentemente. Facendo

una prima analisi senza l’utilizzo di un microscopio, è stato verificato come effet-

tivamente la crescita del fungo nei due diversi tipi di terreni fosse completamente

diversa, come avevamo supposto inizialmente.

(a) Terreno WA + T (b) Terreno MA+T

Figura 2: Piastre con patogeno

• Figura 2 (a): In questo tipo di terreno abbiamo una crescita del patogeno che

risulta essere molto più lenta, accertata dalla presenza di poche colonie, poco

sviluppate; tutto questo è dovuto alla scarsa presenza di nutrienti. La forma

dello sviluppo delle poche colonie presenti sembra essere di tipo rizoide. Non

si verifica la presenza di un micelio aereo. Il colore risulta essere bianco, quasi

trasparente, e la stessa cosa è presente sul retro.

• Figura 2 (b): La crescita del patogeno in questo caso è di tipo micellare, l’aspetto

della colonia non mostra la presenza di un micelio aereo evidente, con una

crescita di tipo filamentoso. La colorazione delle diverse colonie è verde, con

intorno delle schiariture di colore bianco. Il colore del rovescio della colonia

risultava essere sulle tonalità del giallo, tendente a un marrone. La forma

delle diverse colonie è circolare. La colonia centrale risulta essere quella più

sviluppata e presenta un aspetto lanoso, quasi velutino, ed è evidente anche

la tipica crescita miceliare. La velocità è risultata essere normale osservando i

diametri delle diverse colonie.

2.2 Analisi microscopica

Una volta eseguite le osservazioni macroscopiche, siamo andati più nello specifico,

proseguendo con delle osservazioni al microscopio. Per farlo, abbiamo prelevato una

goccia d’acqua, l’abbiamo posizionata al centro di un vetrino e, tramite l’utilizzo

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di una pinza sterile, abbiamo raccolto una porzione del fungo, cercando di non

prelevare anche altri batteri. Una volta preso il campione, quest’ultimo è stato

posto sulla goccia presente sul vetrino, per poi coprirlo con un blocca-vetrino per

non far muovere il campione. Una volta messo il vetrino in posizione è stato possibile

osservare a microscopio i dettagli. Ovviamente l’operazione è stata eseguita due volte

per entrambi i terreni.

Figura 3: Ife settate in terreno MA + T

Osservando a microscopio il campione riferito al terreno MA+T è possibile ve-

rificare come le ife del fungo presentano i setti che permettono il passaggio del

citoplasma e di tutti i nutrienti necessari per permettere l’accrescimento del fungo.

I setti ci danno, inoltre, la possibilità di andare ancora più nello specifico con la clas-

sificazione del fungo preso in esame: quest’ultimo infatti potrebbe essere identificato

come un ascomiceto o un basidiomiceto.

Figura 4: Ife in terreno WA + T

Procedendo con l’osservazione del terreno WA+T, è possibile verificare come lo

sviluppo delle ife del fungo sia effettivamente di tipo rizoide.

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Figura 5: Ascomiceti

Analizzando invece i conidi, cioè le strutture riproduttive del fungo, è possibile

osservare come le spore presenti siano delle Blastospore. Oltre a questo, è possibile

entrare ancora più nello specifico classificando il fungo come un Ascomiceta; se

vogliamo essere più precisi un Penicillium, fungo tipico degli agrumi.

3 Effetto delle condizioni ambientali sulla crescita

dei funghi

3.1 Preparazione delle piastre

In seguito, abbiamo trasferito il fungo su altre piastre per osservare la diversa ti-

pologia di crescita in base a differenti tipi di condizioni ambientali. Dal terreno in

cui il fungo si è sviluppato di più, ovvero il MA+T, abbiamo trasferito due sezioni

di fungo, di circa 0.5 cm, da una colonia, per poi inocularle su due piastre con lo

stesso tipo di terreno MA+ttc. Le piastre, poi, sono state conservate per 18 ore a

temperature diverse: una a 9°C e l’altra a 25°C, entrambe al buio. Ciò che cam-

biava, dunque, tra le tre variabili prese in considerazione (temperatura, esposizione

alla luce e nutrienti) era la temperatura. In base al cambiamento di quest’ultima,

quindi, abbiamo potuto verificare come essa poteva influenzare la crescita del fungo

o meno. 5

3.2 Osservazione delle piastre

Figura 6: Campione del fungo conservato a 25°C al buio per 18 ore

Figura 7: Campione del fungo conservato a 9°C al buio per 18 ore

La crescita nelle due piastre dello stesso fungo risulta essere molto diversa: ciò si-

gnifica che la temperatura ideale per la crescita del fungo è stata quella intorno ai

25°C, mentre il fungo a 9°C risulta avere avuto una crescita molto più lenta. Anche

il colore dei diversi campioni risulta essere di una colorazione molto diversa: nella

piastra di 9°C il fungo, non essendo molto sviluppato, presenta una colorazione bian-

castra, quasi trasparente; l’altra, invece, con una crescita miceliare ben sviluppata,

presenta un colore tendente al verde.

4 Conta delle spore

Abbiamo proseguito le nostre analisi con la conta delle spore, che non solo ci ha

aiutato ad avere una stima del numero di spore generate dal fungo, ma ha anche

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contribuito nel capire come fosse l’andamento di crescita del fungo nel tempo. La

conta è stata eseguita utilizzando delle camere di conta di tipo Bunker, T homa

e N eubauer, dove era presente una griglia a livello del vetrino portaoggetti. La

griglia era suddivisa in griglie più piccole e, in base al tipo di griglia presa in analisi,

si effettuava la conta in quella determinata area. L’area veniva scelta in base alla

concentrazione di spore. Una volta finita la conta, a seconda della zona selezionata,

è necessario fare un calcolo per determinare i CFU/ml (unità formanti colonia in

1 ml di soluzione). La conta che è stata presa in considerazione, nel mio caso,

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×

riguarda il quadrato che prevede questo tipo di calcolo: A 10 . Dopo aver contato

nel quadrato prescelto 32 spore, ho eseguito il calcolo ed è risultato che CFU/ml =

320.000 Figura 8: Conta spore al microscopio

5 Prova di biocontrollo in vitro

Dopo la conta delle spore, abbiamo eseguito una prova di biocontrollo in vitro. Per

mettere in pratica quest’analisi, prima di tutto, abbiamo aggiustato la concentrazio-

ne di sospensione delle spore, preparando una eppendorf contenente 100ul di spore

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×

(2 10 CFU/ml) + 100ul 0,1% WA.

Successivamente abbiamo preso tre piastre, tutte con terreno MA e, in ognuna, sono

state trasferite poi le spore del fungo preso in esame. Su due di queste sono stati poi

trasferiti due tipi di batteri differenti. La disposizione delle piastre era la seguente:

1. Piastra di controllo - solo il fungo (spore 10ul) al centro della piastra

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2. Piastra B - in centro il fungo (spore 10ul) e 10ul di batterio Bacillus B21 (B)

3. Piastra S – in centro il fungo (spore 10ul) e 10ul di batterio Streptomyces

IPV2742 (S)

Tramite questa prova di biocontrollo abbiamo osservato la modalità di crescita

del fungo in assenza o in presenza di due diversi tipi di batteri. Prendendo in

esame la prima piastra, possiamo vedere come il fungo sia cresciuto in maniera

regolare. Con la piastra numero due, invece, possiamo osservare come, nonostante

la presenza del batterio Bacillus, la crescita del fungo sia stata molto veloce ed

espansiva. Al contrario quella della terza piastra, in cui, tramite la presenza del

batterio Streptomyces, la crescita del fungo nei dintorni della presenza del batterio

non c’è stata. 8