Proteine, riconoscimento molecolare, legami secondari, strutt terz, folding, malattie da misfolding

Nella struttura terziaria, interazioni intramolecolari. =disposizione

spaziale degli atomi di una proteina e è il risultato delle interazioni tra le

catene laterali degli amminoacidi della catena. Data la sequenza

degli amminoacidi la struttura 3d viene di conseguenza. La struttura

3D è anche la struttura attiva. Se la prot viene degradata perché si

spezzano i leg deboli, si denatura parzialmente o totalmente, perde

la sua attività biologica.

E’ legata alla solvatazione, all acqua, se non fossimo in acqua

succederebbero cose diverse.

Le parti con tanti atomi di C sono idrofobiche quindi non interagiscono

con l acqua. Quindi si viene a formare un dominio globulare con un core

idrofobico. Le parti idrofiliche invece interagiscono con l acqua con

legami idrogeno. Utilizzando un solvente organico o il vuoto si

otterrebbero altre strutture. Ripiegamenti dominati dalle interazioni

idrofobiche. Dopodichè si instaurano gli altri leg. Conformazione

ripiegata o folded.

La maggior parte delle proteine sono sferiche, globulari e

presentano entrambe le strutture secondarie, alpha elica e foglietto beta,

a seconda delle regioni ma in alcune prevale l una rispetto all altra. I

motivi sono una combinazione di strutture secondarie. Alcuni motivi

hanno significato funzionale altri solo strutturale. I foglietti beta

formano il core idrofobico interno mentre le alpha eliche sono

protese verso l

esterno perché idrofiliche, questo generalmente.

Rappresentazione cartoon:

Processo di folding proteico

Struttura nativa di una proteina è la struttura terziaria ed è il

risultato delle interazioni sec degli amminoacidi della proteina. Le

interaz a corto raggio sono le prime, poi quelle a lungo raggio.

Il passaggio da s.prim a s.terz è un processo multistadio, in cui la

proteina da unfolded sperimenta delle configurazioni intermedie

diverse da quella nativa che la portano fino a quella corretta.

E’ un processo stocastico, la proteina può partire da diverse config

diverse con la stessa energia, poi l energia si riduce a ogni

ripiegamento, con configurazioni parzialmente stabili, le barriere

energetiche che devono essere superate sono basse e quindi cambiano

continuamente config. Ricerca stocastica delle configurazioni possibili.

Tutti gli intermedi sono strutture parzialmente ripiegate con

somiglianza alla struttura nativa ma non hanno la precisa

stechiometria della s nativa. Alcune configuraz danno funzionalità.

Alla fine, la proteina può rimanere bloccata a un intermedio

sbagliato (misfolding) o raggiungere la s nativa (folding).

Il processo di folding nel passato si pensava avvenisse in un solo

collasso, singolo stadio, in modo deterministico. Nella realtà avviene a

stadi, in cui per uscire da ogni configuraz e passare a quella

successiva deve superare una certa soglia di energia.

Prima s.sec, poi si formano i fasci o motivi con i turn.

Cilindri=alphaeliche, frecce =betasheet. A corto raggio. Impiegando ms.

A lungo raggio quando si formano ulteriori ripiegamenti fino alla s terz

nativa. In meno di 1s.

Proteine di ausilio al folding

La proteina nasce dal ribosoma con la sintesi proteica, che produce

amminoacido per amminoacido la proteina. Il processo non è

velocissimo, quindi il processo di folding e di sintesi sono

correlati, il ribosoma non produce istantaneamente il peptide, fa 4-20

amminoacidi al secondo ma la velocità di ripiegamento della proteina è 1

sec. Il peptide inizia a foldare prima di essere completamente

prodotto. Inoltre, nel citosol ci sono altre proteine che interagiscono

con il peptide e altre sostanza. Le parti con carattere idrofobico, in

mancanza degli altri domini della proteina con cui andrebbero a

interagire formando il core idrofobico se la proteina fosse completamente

prodotta, interagirebbero con altri elementi idrofobici presenti nel

citosol formando dei complessi proteici non voluti oppure gli aa già

prodotti cominciano ad interagire tra loro prima della fine del processo,

dando luogo a ripiegamenti errati, da cui potrebbe non essere facile

uscire dal pov energetico.

Quindi esistono dei complessi di ausilio del processo di folding. Per

anni si è pensato che la proteina foldasse da sola perché la sequenza

amminoacidica contiene tutte le info per il corretto folding, ma non

basta la sequenza primaria.

Alcune di queste proteine sono chiamate heat-shock proteins. Sono

prodotte dalla cell in grande quantità in momenti di stress ossidativo,

innalzamento della temperatura, cambiamenti di pH, che

denaturerebbero in parte le proteine. Sono classificate in base al peso

molecolare (il numero dà la dimensione in kDa).

Generalmente lavorano in coppia. Hanno siti idrofobici in grado di

legare i siti idrofobici esposti dalle proteine che non sono

correttamente foldate, riconoscendoli e coprendoli per evitare che

queste regioni venissero catturate da altre molecole, sono un

meccanismo protettivo. Quindi la catena nasce e prosegue ma non

ripiega preventivamente, perché le HSP durante la sintesi proteica si

agganciano alle zone idrofobiche (di solito foglietti beta), in diversi

punti, finchè la produzione non è finita. Le due coinvolte sono la 40

e la 70. Sono dei chaperoni di folding, quindi assistono la proteina

durante il processo di sintesi, per poi sganciarsi alla fine. Riconoscono

parti idrofobiche e cisteine singole, perché dovrebbero sempre

essere le prime all interno della proteina nel core idrofobico e le seconde

in coppia per poi legarsi tramite ponte disolfuro.

Ci sono poi le chaperonine di holding e unfolding. Sono complessi

proteici, con forma a toroide con cavità centrale disposti in due

strati a sandwitch, sono in grado per la loro dimensione di alloggiare le

proteine all interno. Le holding prendono le prot non ancora

foldate o parzialmente fondate, o misfoldate per poi passarle a

quelle di unfolding che nel caso delle misfolded le riportano allo

stato iniziale per poi permettere loro il folding corretto. Quelle di

unfolding possono anche, dato che hanno affinità per i proteasomi, far

distruggere le prot misfolded.

Comunque rimangono alcune prot misfolded. Esiste un meccanismo di

controllo di queste prot. Può succedere che ci sono dei fattori che

spostano l equilibrio verso le prot misfolded, fattori ambientali o

patologici (stati infettivi) o cellulari (fattori di crescita) ecc. Inoltre, le

chaperonine e i chaperoni sono in numero limitato quindi se

queste prot sono troppe non riescono ad assisterle. Le prot

sperimenteranno quindi degli intermedi stabili, che poi possono invece

che ripiegarsi su se stessi in modo intramolecolare ma chiudersi in

modo intermolecolare, congiungendo i beta sheet. Cioè si innesca

il processo di aggregazione proteica. Possono essere solubili cioè poi

dissociarsi, oppure insolubili che portano a specifiche patologie. Delle

proteine sono predisposte a formare aggregati fibrillari e sono

chiamate proteine amiloidi.

Tecniche di studio del folding

Il processo di folding è molto studiato perché il misfolding è all

origine di diverse patologie. Per vedere se questi intermedi stabili

per es hanno funzione (patologica) o non ce l hanno, o il tempo di

folding.

Ci sono molte tecniche es il dicroismo circolare, che misura la % dei

diversi tipi di strutture secondarie, ad alpha elica o beta sheet o non

strutturata, presenti nella proteina, per capire per es l idrofobicità e

quindi la propensione a formare fibre amiloidi. Metodi che partivano da

prot in struttura nativa, venivano provocate con blande dissociazioni per

vedere cosa succedeva.

Le tecniche di dinamica molecolare permettono di simulare

condizioni simili alle sperimentali, in ambienet solvatato e in

temperatura (37°), si lascia vedere come evolve il sistema. Simula l

evoluzione nel tempo delle conformazioni sperimentate dalla

molecola dalla catena lineare iniziale, dovute al force field cioè le

interazioni tra atomi. Grafico che mostra il confronto tra tempo di

folding misurato sperimentalmente e quello predetto dalla simulazione. I

risultati sono abbastanza

allineati e coerenti, il metodo è stato validato per piccole molecole come

la villina, e peralphaeliche e betasheets.

Esempio: la villina, responsabile dell organizzazione dei fasci di actina nei

microvilli. E’ una proteina costituita da 36 amminoacidi o residui. 5 di

questi sono idrofobici e aromatici, 4 fenilalanine e 1 tirosina. 3 formano il

core idrofobico e 2 rimangono all esterno. Le simulazioni mostrano il

processo di folding, che termina quando la prot continua a vibrare

attorno a una posizione intermedia. Il tempo di folding è di 10 microsec,

molto veloce. Le simulazioni sono utili perché danno anche info in più

rispetto agli esperimenti es posizione degli atomi nello spazio in

ciascuna delle varie configurazioni intermedie.

Esiste un software che si chiama Alphafold che si basa sull Ai e su

database di strutture risolte. Le tecniche di cristallografia a raggi X e

NMR sono di solito usate. Per proteine di cui non è nota la struttura,

ricostruisce sulla base della sequenza una probabile struttura 3D per

poi usarla per la simulazione. Si possono anche dare altre info all

algoritmo perché sperimentalmente note.

Il sistema di controllo di primo livello del folding proteico

E’ a livello del reticolo endoplasmatico. Ribosoma agganciato al

reticolo che produce il peptide. La catena nascente è all interno di un

ambiente ricco di chaperoni e chaperonine, che coadiuvano il suo

folding. Poi abbiamo 3 possibilità: l intermedio folda correttamente e

allora viene mandato al Golgi; diventa misfolded, allora vengono

etichettate da una molecola segnale che è l ubiquitina, una sequenza di

ubiquitine, che segnalano la sua presenza sia alle chaperonine che al

proteosoma. Le chaperonine cercano di far rifoldare la proteina e

riportarla allo stato nativo, mentre i proteosomi la degradano

rimettendo in gioco i suoi aa, usando atp; si formano degli

aggregati, quando ci sono alte [] di prot misfolded, rimane un

intermedio di folding che interagisce con altri intermedi.

Sono tutte doppie frecce: gli aggregati, se sono solubili, a causa dei

moti browniani possono tornare allo stato di intermedi e seguire altre

strade; anche le folded se cambia qualcosa nell ambiente possono

tornare a intermedi; anche la misfolded, se presa in carico dai chaperoni,

può tornare a intermedio da refoldare.

Questi riconoscimenti si basano su regioni idrofobiche o cisteine

singole esposte.

Le heat shock proteins agganciano la prot. Poi intervengono 3 enzimi.

L enzima E1 carica un ubiquitina, grazie all atp, formando un leg

cov di tipo tioestere (tra la cys dell E1 e la gly dell U). Poi E1 passa l

ubiquitina a E2, attraverso una transtioesterifica