Biologia molecolare delle proteine

Biologia molecolare delle proteine 2017-2018

Prof.ssa Cattane e Prof.ssa Entratoli

Formazione degli amminoacil-tRNA

Il caricamento dei tRNA richiede la formazione di un legame covalente tra l'AA e il 2'-OH o 3'-OH del ribosio dell'adenosina che protrude dallo stelo accettore. Questo legame è formato da una specifica amminoacil-tRNA sintetasi, ed è ad alta energia.

Meccanismo dell'amminoacil tRNA sintetasi

L'AA da caricare deve essere adenilato, a partire da ATP, con formazione di pirofosfato. Poiché la reazione è energeticamente svantaggiosa, una pirofosfatasi idrolizza il PP in 2Pi, portando l'equilibrio di adenilazione verso i prodotti. Una volta attivato, l'AA viene attaccato sul tRNA carico dell'AA (AMMINOACIL-tRNA), e il rilascio dell'ATP.

Per fare ciò ogni AA-tRNA sintetasi ha 3 siti di legame:

• Sito di legame per l'ATP: stabilizza l'ATP usato per attivare l'AA.
• Sito di legame per l'AA [SPECIFICO, v. dopo]
• Sito di legame per il tRNA [SPECIFICO, v. dopo]

NB. Una volta caricato l'AA è impossibile correggere eventuali errori di associazione AA/tRNA. Per questo, con i meccanismi seguenti, è garantita l'alta specificità di accoppiamento.

Cioni di aminoacil tRNA sintetasi

Esistono 20 Aminoacil sintetasi differenti, ciascuna delle quali carica tutti i tRNA corrispondenti a un solo AA - quindi ogni sintetasi è specifica per ogni AA, ma può caricare più tRNA ∇AA (a causa della degenerazione del codice). I 20 enzimi sono raggruppabili in 2 cloni, differenti per motivi strutturali, meccanismo di riconoscimento del tRNA, meccanismo di riconoscimento dell'anticodone e sito di aminoacilazione.

Classe I e Classe II delle aminoacil-tRNA sintetasi

• Classe I
  • Met RS
  • Val RS
  • Leu RS
  • Ile RS
  • Gyr RS
  • Arg RS
  • 10 enzimi
• Classe II
  • Ser RS
  • Thr RS
  • Ala RS
  • Gly RS
  • Pro RS
  • His RS
  • 10 enzimi

Diversità strutturali

Il dominio catalitico è molto differente nelle due cloni, e l'ordine dei domini nella sequenza dimostra l'evoluzione convergente di queste.

Modalità di aminoacilazione

Il tRNA si distorce sempre sull'enzima per presentare ad esso lo stelo accettore, ma in modo peculiare nelle due cloni:

• CL I ⇒ il tRNA presenta lo stelo accettore favorendo il legame 2'-OH / AA
• CL II ⇒ il tRNA presenta lo stelo accettore favorendo il legame 3'-OH / AA

Specificità delle amminoacil-tRNA sintetasi

La specificità delle sintetasi è doppia: esse devono riconoscere il tRNA esatto e in seguito ancorarvi l’AA esatto.

Riconoscimento del tRNA

I determinanti della specificità tRNA/serina sono raggruppati nello stelo accettore e nell’ansa dell’anticodone. La correzione di base è di tipo cinetico: tRNA esatti si ancorano rapidamente, inducendo un cambio conformazionale utile alla catalisi successiva. tRNA errati si ancorano molto più lentamente, e la catalisi dell’amminoacilazione avviene molto lentamente.

NB: La frequenza di errore di appaiamento è 1/10⁴

Riconoscimento dell’AA

Date le scarse dimensioni degli AA la specificità di legame è un processo più complesso, e richiede un sito di editing che lavori come un doppio setaccio:

• Gli AA troppo grandi saranno scartati per ragioni di ingombro sterico del sito di sintesi.
• Gli AA troppo piccoli entrano nel sito di sintesi, ma non nel sito di editing (più piccolo di quello di sintesi).

Solo gli AA con il giusto ingombro sterico e le adatte proprietà chimiche rifilano perfettamente entrambi i siti, e vengono sottoposti alla catalisi.

NB: Il trasferimento dell’AA tra i due siti è dato da un cambio conformazionale del tRNA

S = sito di sintesi

E = sito di editing

AA troppo grande AA troppo piccolo AA esatto.

Riconoscimento codone-anticodone

Durante la sintesi proteica l'AA-tRNA corretto viene selezionato sul messaggero per l'interazione codone/anticodone.

NB: A questo riconoscimento non partecipa l'AA: modifiche chimiche dell'AA di un AA-tRNA non variano la specificità di associazione sul messaggero.

Note di nomenclatura

• 5'-ACG-3' CODONE (mRNA)
• 3'-UGC-5' ANTICODONE (tRNA) → La 1^a base dell'anticodone riconosce la 3^a base del codone.

Ipotesi dell'oscillazione della terza base

Molti tRNA riconoscono più di un solo codone ∀ AA (il codice è degenerato), e ciò è dovuto alla bassa influenza che ha la terza base di ogni codone sul codone stesso.

Ipotesi dell'oscillazione: sono possibili interazioni non W/C a livello della 1^a base dell'anticodone. Nella maggior parte dei casi infatti la 3^a base è irrilevante ai fini del giusto appaiamento (eccezioni: AUG, UGG).