Biologia molecolare delle proteine

Biologia Molecolare delle Proteine

2017 - 2018

Prof.ssa Lutheran

FORMAZIONE DEGLI AMMINOACIL-tRNA

Il caricamento dei tRNA richiede la formazione di un legame fosfoestere tra l'AA e il 2'-OH o 3'-OH del ribosio dell'adenina che protrude dallo stelo accettore. Questo legame è formato da una specifica amminoacil-tRNA sintetasi, ed è ad alta energia.

Meccanismo delle amminoacil tRNA sintetasi

1. L'AA da caricare deve essere adenilato, a partire da ATP, con formazione di pirofosfato. Poiché la reazione è energeticamente svantaggiosa, una pirofosfatasi idrolizza il PP in 2Pi, spostando l'equilibrio di adenilazione verso i prodotti.
2. Una volta attivato, l'AA viene attaccato sul suo C carbossilico dal 2'-OH o dal 3'-OH dell'adenina dello stelo accettore del tRNA. Il risultato dell'attacco nucleofilo è il tRNA carico dell'AA (amminoacil-tRNA), e il rilascio dell'ATP.

Per fare ciò ogni AA-tRNA sintetasi ha 3 siti di legame:

• SITO DI LEGAME PER L'ATP: stabilizza l'ATP attivato per attivare l'AA
• SITO DI LEGAME PER L'AA [SPECIFICO, v. dopo]
• SITO DI LEGAME PER IL tRNA [SPECIFICO, v. dopo]

NB: Una volta caricato l'AA è impossibile correggere eventuali errori di associazione AA/tRNA. Per questo, con i meccanismi seguenti, è garantita l'alta specificità di accoppiamento.

Codon usage

Il n° minimo di tRNA per tradurre tutte le 64 triplette del codice che codificano per AA è di 32. Ma nelle cellule ci sono sempre più di 32 tRNA, e in genere i codoni più usati in ogni organismo corrispondono al tRNA in esso più abbondanti. (CODON USAGE)

Bisogna tener conto di ciò nella produzione di proteine ricombinanti: trasportati in organismi con codon usage molto differenti da quello in cui il mRNA è stato la sintesi del costrutto può dare blocco della traduzione.

Soppressione intergenica di nonsense e di frameshift

Normalmente non esistono, nella cellula, tRNA complementari ai codoni di STOP. Mutazioni dei tRNA, però, possono renderlo tali. I tRNA che si ancorano a codoni di STOP sono detti SOPPRESSORI DI NONSENSO, perché possono contrastare le mutazioni nonsense, cioè quelle che generano codoni di STOP prematuri.

L’appaiamento di un soppressore nonsense a uno STOP precoce permette di aggiungere un AA casuale, bypassando la mutazione.

• Nei batteri la pressione selettiva può indurre la formazione di soppressori nonsense se la mutazione nonsense riguarda una proteina essenziale alla sopravvivenza cellulare.

NB: I soppressori di nonsense sono poco rappresentati perché pericolosi: potrebbero mascherare il reale codone di STOP di una ORF producendo una proteina anormalmente allungata (anche se di norma nel 3’UTR sono presenti STOP sufficienti a far fermare subito la traduzione).

Esistono anche tRNA soppressori di frameshift, cioè mutati in modo da riconoscere 4 basi invece che 3, assorbendo così l’errore di inserzione di una singola base.

INIZIO DELLA TRADUZIONE EUCARIOTICA

Negli eucarioti la tappa di inizio è molto più complessa. Le principali differenze con l'inizio procariotico sono:

• Il tRNAⁱ è già carico sulla sub. minore, che scorre in 5'-3' sull'mRNA fino a riconoscere l'AUG.
• Il n° di fattori di traduzione è molto maggiore.

1. Formazione del Complesso di Pre-Inizio (PIC);
2. Attivazione del 5' dell'mRNA;
3. Riconoscimento AUG e formazione del complesso di inizio.

• 1️⃣ FORMAZIONE DEL PIC

  ^{(SUB. 40S)}

  eIF1 e eIF3 legano la sub. 40S, impedendo che il tRNAⁱ entri nel sito A. Nel frattempo eIF6 lega la sub. 60S impedendo un'associazione precoce. eIF2/GTP, poi, si associa al tRNAⁱ (che è un Met-tRNA NON FORMILATO!) e lo guida nel sito P, dove si associa anche a eIFS (che poi ne idrolizza il GTP).

  Ora il PIC (43S) è pronto per interagire con l'mRNA.

• 2️⃣ ATTIVAZIONE DELL' mRNA

  Il Cap 5' viene riconosciuto e legato da eIF4E; il quale si associa a eIF4G (che sfugge dal punto di controllo traduzione) e a eIF4A, che ha un'attività EUCASICA. E, eIF4A formano il complesso "eIF4F". Al complesso giungono eIF4B, che attiva il ciclo di eIF4A (che può quindi avvolgere le strutture alte/lame dell'mRNA rendendole lineare).

  In una 2° fase il 5' e 3' dell'mRNA interagiscono tramite la poli-A-BP a dare il circolo polisomico.

Regolazione Traduzionale

La regolazione e il controllo della traduzione è utile alla cellula per modulare in modo rapido e fine la risposta proteica come reazione agli stimoli esterni.

Regolazione procariotica e generale

• Risposta stringente

In caso di carenza di AA - segnalato dall'ingresso di tRNA scarichi nel ribosoma - la proteina ribosomiale L4 attiva l'enzima RelA, che sintetizza, nel ribosoma, a partire da GTP (ppp5'-G-3'OH) il composto ppp5'-G-3'pp e poi, da questo, il pp5'-G-3'pp. Il pp5'-G-3'pp inibisce l'RNA polimerasi, che quindi non trascrive più rRNA e tRNA: si instaura una condizione citostatica.

• Regolazione autogena della proteosintesi

Esistono delle proteine che formano completi macromolecolari. La tubulina, ad esempio, è presente in eccesso non si associa ai microtubuli, e i monomeri liberi reprimono la traduzione della tubulina stessa legando nei ribosomi e inducendo la degradazione del messaggero. Le stesse proteine ribosomiali, ad esempio, tendono ad accumularsi se non c'è rRNA da associare (come in stato di risposta stringente), e una di queste proteine in forma libera lega l'mRNA e impedisce traduzioni.

• Attenuazione

L'esempio classico è quello dell'operone trp in E.coli.

• Competizione per l'RBS

La traduzione può essere regolata tramite fattori specifici che competono con il ribosoma per il legame all'RBS.

Heat-Shock Proteins: Hsp-70 e simili

Le comuni Heat-Shock sono:

• Citosoliche: DNA K (E. coli), Ssa1-4 (Lievito), Hsp70 (Eum. superiori)
• Ancorate al RE: Bip (Grp78) (Eum. superiori), Kar-2 (Lievito)

La concentrazione intracellulare delle Heat-Shock è molto alta, di ~50 μM, superiore a quella dei ribosomi (~30 μM)

DNA K e co-chaperone

DNA K (la dapsonina di E. coli) lega peptidi di ~7 residui, con preferenza per Leu e Ile (~1 peptide/40 residui), e con affinità che si limita a 5 nM a 5 μM.

Per funzionare richiede un co-chaperone, DNA J, e alcuni fattori (grp-E per il rilascio di ADP, Sti1 e Hap per organizzare il complesso, Bag1/5 per la dissociazione)

Hsp70 e ciclo catalitico

Hsp70 è la Heat-Shock Protein degli eucarioti superiori, e si lega in modo ATP-dipendente ai peptidi: solo l’idrolisi di ATP mediata dal suo co-chaperone Hsp40 (=DNA J proc.) permette a Hsp70 di assumere una conformazione chiusa, col peptide stabilizzato tra i suoi domini.

Di seguito è schematizzato il ciclo catalitico.

NB. RIL è il fattore di scambio dei nucleotidi (=GrpE proc.), che espleta l’ADP della Hsp70 che ha appena fatto la catalisi

Localizzazione mitocondriale

Le proteine con la sequenza segnale per i mitocondri sono importate in seno dell’interazione dei complessi TIM/TOM.

Dopo il contatto tra il recettore di importazione, la sequenza segnale viene inserita nel canale delineato formato da TIM e TOM (TIM = Translocatore, Outer Membrane; TIM = T. Inner Membrane). Nel frattempo la proteina è tenuta unfolded da Hsp70 citosoliche, che si dissociano solo con spesa di ATP. Una volta nella matrice, una peptidasi del segnale (SP) taglia la sequenza segnale, mentre la proteina apposta importata viene aiutata coadiuvata dalle Hsp70 mitocondriali. Questo meccanismo è dipendente dal gradiente elettrochimico: se il mitocondrio è morto il gradiente è dissipato, e ciò impedisce importazioni inutilmente dispendiose.

Localizzazione nucleare

Attraverso i complessi del poro nucleare transitano liberamente molecole ≤ 50 kDa. Tutte le altre hanno bisogno di NLS (Nuclear Localization Sequence, per l'importazione) e di NES (Nuclear Export Sequence, per l'esportazione), e di proteine accessorie. Di seguito le catene dell'importazione, comunemente anche a quelle di esportazione. L’importina (recettore di importazione nucleare) capta la sequenza segnale e lega la proteina. Il complesso del poro ammette il passaggio dell’importina, che una volta nel nucleo viene caricata di Ran-GTP (Ran-GTP ha trasporto), grazie a GEF (Guanine Exchange Factor), e rilascia la proteina. L’importina Ran-GTP rientra nel citosol, e si idrolizza di GTP in GDP ad opera di Ran Affinity citosolica, e GAP (GTPase Activiting Protein) fa diminuire Ran, rendendo quindi l’importina pronta per una nuova funzione.

NB: la distribuzione di RanGTP e GDP è garantita di fato da GAP,e citosolica, mentre GEF è nucleare.