Patologia generale

Oncologia: regolazione dell'espressione genica

Genoma

Con il termine genoma si intende in biologia il complesso dei geni di una cellula o di un organismo. Il genoma umano è costituito da 23 coppie di cromosomi, per un totale di 46 cromosomi complessivi. Di questi, 44 (22 coppie) sono cromosomi somatici (o autosomi, cromosomi non sessuali) uguali nell’uomo e nella donna, mentre 2 (1 coppia) sono cromosomi sessuali (o eterosomi) e sono diversi nell’uomo e nella donna - in particolare, sono XX nella donna e XY nell’uomo. In totale, il genoma umano comprende 8 miliardi di coppie di basi e circa 30 mila geni.

Gene

Il gene è una unità trascrizionale collocata in una precisa posizione all’interno della catena del DNA. Tutte le cellule dell’organismo (ad eccezione dei globuli rossi e delle piastrine, che sono cellule anucleate) contengono l’intero corredo genetico, ma la diversità tra una cellula e l’altra è legata alla diversa espressione dei vari geni. Per questa ragione, è importante conoscere i meccanismi che regolano l’espressione genica.

Espressione genica

In biologia molecolare, con il termine espressione genica si intende il processo attraverso cui l'informazione contenuta in un gene viene convertita in una macromolecola funzionale (tipicamente una proteina) che prende il nome di prodotto genico. La regolazione dell’espressione genica può avvenire a livello trascrizionale o a livello traduzionale.

Trascrizione

La trascrizione è il processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA: concettualmente, consiste nel trasferimento dell’informazione genetica dal DNA all’RNA. Questo processo è catalizzato da una famiglia di enzimi genericamente detti RNA polimerasi. È possibile distinguere tre tipologie di RNA polimerasi:

• RNA polimerasi di tipo I: Si trovano nel nucleo, in una regione particolarmente densa di materiale genetico e proteico, e portano alla formazione di RNA ribosomiale (rRNA);
• RNA polimerasi di tipo II: Si trovano nel nucleoplasma, una porzione di matrice gelatinosa presente nel nucleo, e portano alla formazione di RNA messaggero (mRNA);
• RNA polimerasi di tipo III: Si trovano anch’esse nel nucleoplasma e portano alla formazione di RNA transfer (tRNA).

In seguito alla trascrizione, si forma un trascritto primario (pre-mRNA) che subisce una serie di modificazioni post-trascrizionali, che portano, alla fine di un processo detto di maturazione, alla formazione dell’mRNA maturo. Le tappe della maturazione sono essenzialmente tre:

• Splicing: Consiste nella rimozione degli introni (regioni non codificanti di un gene) e nella conseguente unione degli esoni (regioni codificanti di un gene);
• Capping: Consiste nell’aggiunta di un “cappuccio” di 7-metil guanosina al residuo 5-terminale della molecola di pre-mRNA;
• Poliadenilazione: Consiste nell’introduzione di una sequenza poliadenica all’estremità 3’ del pre-mRNA tramite legame covalente, con formazione di una coda poli(A).

Traduzione

La traduzione è il processo attraverso il quale l’informazione contenuta nel mRNA maturo viene convertita in un prodotto genico rappresentato da proteine che svolgono un’ampia gamma di funzioni (proteine strutturali, proteine funzionali, proteine enzimatiche, proteine regolatorie). La macchina esecutrice della sintesi proteica è rappresentata dai ribosomi, localizzati sul reticolo endoplasmatico rugoso. La proteina che si forma subisce poi una serie di modificazioni post-traduzionali.

Porzione codificante e porzione regolatoria

In un gene è possibile distinguere una porzione codificante e una porzione regolatoria. La porzione codificante di un gene è costituita da esoni intervallati da introni (porzioni non codificanti). La porzione regolatoria di un gene è costituita da sequenze promoter o da sequenze enhancer.

Il promoter (promotore) è rappresentato da una sequenza modulare di circa 200 coppie di basi localizzata a monte del gene di cui inizia la trascrizione, a una distanza di circa 40-100 coppie di basi; il promotore lega la RNA polimerasi e, in questo modo, consente di iniziare la trascrizione del gene corrispondente. L’enhancer è invece una sequenza di basi, non necessariamente prossime al gene corrispondente, a cui si legano diversi fattori trascrizionali promuovendone la trascrizione.

Geni costituitivi e geni inducibili

Una prima classificazione distingue i geni costituitivi e i geni inducibili.

• Geni costitutivi (housekeeping genes): Sono geni attivamente trascritti e tradotti a un livello relativamente elevato; sono generalmente geni che codificano per prodotti genici fondamentali per la vita della cellula e che, pertanto, devono essere sempre presenti, in tutte le cellule e in qualunque momento. Un esempio tipico di gene costitutivo è il gene che codifica per l’actina, proteina di struttura importante per la formazione del citoscheletro.
• Geni inducibili: Sono geni la cui trascrizione e traduzione si trovano sotto stretto controllo cellulare, secondo quel processo che prende il nome di regolazione genica.

Promotori basali: I geni costituitivi sono dotati, a monte, dei cosiddetti promotori basali, vale a dire di sequenze nucleotidiche regolatorie minime, formate essenzialmente da tre elementi:

• TATA box: È una sequenza canonica, comune a tutti gli organismi, localizzata nel nucleo del promotore e formata da coppie di basi azotate appaiate secondo lo schema adenina-timina (timina adenina timina adenina, da cui il nome TATA); la TATA box lega il fattore di trascrizione TBP (TATA binding protein) e questo legame induce una modificazione conformazionale nella catena del DNA tale da promuovere il legame di ulteriori fattori di trascrizione e dell’RNA polimerasi II al promotore.
• CCAAT box: È una sequenza nucleotidica posta 100-150 coppie di basi a monte rispetto alla TATA box; essa lega le C/EBPs (CAAT/enhancer binding proteins), influenzando l’efficienza del promotore.
• GC box: Anch’essa posta 100-150 coppie di basi a monte del promotore, lega il fattore di trascrizione SP1 (stimulatory protein 1), con funzione simile a un enhancer.

Promotori inducibili: I geni inducibili, al contrario, sono dotati, a monte, di promotori inducibili che, oltre agli elementi basali, contengono anche degli elementi di risposta specifici: in questo modo, i geni inducibili vengono espressi non costitutivamente, ma solo in presenza di particolari stimoli intracellulari o extracellulari rappresentati da fattori di trascrizione.

Ad esempio, l’HSE (heat shock responsive element) è una sequenza localizzata nei promoter che lega il fattore di trascrizione HSF (heat shock factor) solo in precise condizioni. In condizioni di temperatura corporea normale (37 gradi), HSF è a riposo; in condizioni di ipertermia, invece, si attiva a seguito di fenomeni di fosforilazione o trimerizzazione e si lega a HSE, facendo sì che venga promossa la trascrizione delle HSP (heat shock proteins).

Lo stesso vale per l’elemento di risposta ai glucocorticoidi (GRE), che lega il corrispondente fattore di trascrizione attivato in presenza di glucocorticoidi.

Fattori di trascrizione

I fattori di trascrizione sono proteine in grado di legare il DNA in corrispondenza di regioni specifiche localizzate su un promotore o su un enhancer, regolando la trascrizione. Come per geni e promotori, anche per i fattori di trascrizione è possibile distinguere tra fattori di trascrizione costitutivi, che comprendono i fattori di trascrizione dell’apparato basale di trascrizione (TBP, C/EBPs, SP1) e fattori di trascrizione inducibili, di cui fanno parte quelli che si attivano in specifiche condizioni e legano gli elementi di risposta specifici (HSF).

In linea generale, i fattori di trascrizione devono avere due proprietà: devono riconoscere siti di legame specifici su promotori ed enhancer e devono riconoscere siti di legame sull’RNA polimerasi o su altri elementi regolatori. Per espletare queste funzioni, tutti i fattori di trascrizione sono dotati di due domini: un dominio per il legame con il DNA e un dominio per il legame con la RNA polimerasi o altre proteine.

Per poter interagire con il DNA, i fattori di trascrizione necessitano di essere attivati. L’attivazione di un fattore di trascrizione è un processo che può avvenire con diverse modalità:

• Biosintesi ex novo: Per esempio il caso del fattore di trascrizione fos, che gioca un ruolo importante nel processo di proliferazione cellulare; una cellula appena nata, infatti, non può proliferare immediatamente, ma necessita di almeno 30 minuti: questo è legato al fatto che per poter proliferare è prima necessaria la trascrizione del gene c-fos e la conseguente produzione del fattore di trascrizione fos.
• Fosforilazione: Per esempio il caso del fattore di trascrizione jun, che viene attivato per aggiunta di un gruppo fosfato proveniente dall’ATP.
• Defosforilazione: Per esempio il caso del fattore di trascrizione NFAT, importante nella risposta immunitaria.
• Degradazione di un inibitore: Per esempio il caso del fattore di trascrizione NFkB, che si trova nel citoplasma legato alla proteina inibitoria IkB; in condizioni specifiche (ad esempio per azione di TNF-alfa), viene attivato dal complesso proteico a funzione chinasica IKK, che fosforila IkB e ne predispone la degradazione proteosomica; libero da IkB, NFkB risulta attivato.
• Legame con un ligando: Per esempio il caso dei recettori per gli steroidi, che normalmente si trovano nel citoplasma legati a una proteina inibitoria: lo steroide scalza la proteina inibitoria e, legandosi al recettore, lo rende in grado di migrare nel nucleo e interagire con il DNA.
• Oligomerizzazione: Per esempio il caso di HSF, che in condizioni normali si trova nella forma monomerica inattiva ma che, sotto stimoli rappresentati principalmente dall’ipertermia, trimerizza divenendo in grado di interagire con HSE.

Controllo epigenetico dell'espressione genica

L’espressione genica può subire anche un tipo di regolazione epigenetica, che si basa su tre fenomeni: metilazione del DNA, acetilazione degli istoni, RNA interference.

Metilazione del DNA

La metilazione del DNA è una modificazione biochimica che coinvolge l’aggiunta di un gruppo metile a livello del carbonio 5 di una citosina ad opera della famiglia enzimatica della DNA-metiltransferasi. La metilazione del DNA è associata a una repressione della trascrizione (silenziamento).

La metilazione può influire negativamente sulla trascrizione in due modi:

• La sequenza bersaglio metilata può non essere riconosciuta dal fattore di trascrizione;
• La sequenza bersaglio metilata può essere riconosciuta da una famiglia di repressori trascrizionali;

I pattern anormali di metilazione del DNA sono stati associati ad un gran numero di neoplasie umane e si trovano in due forme distinte: ipermetilazione e ipometilazione rispetto al tessuto normale.

L'ipermetilazione è una delle principali modifiche epigenetiche che reprimono la trascrizione attraverso la regione promotrice di un gene oncosoppressore; in questo caso, l’ipermetilazione si verifica in genere nelle isole CpG (regioni genomiche ad elevata densità di citosina-fosfato-guanina) che normalmente sono regioni di ipometilazione, ma che, in caso di pattern alterato di ipermetilazione, vengono ipermetilate con conseguente inattivazione genica. L’ipometilazione è stata anche coinvolta nello sviluppo e nella progressione del cancro attraverso meccanismi diversi.

Il cancro non è l’unica patologia associata alla metilazione del DNA: tra le principali sindromi genetiche legate a un errato silenziamento dell’espressione genica c’è la sindrome di Rett. La sindrome di Rett è un disordine neurologico che colpisce prevalentemente il sesso femminile, rappresentando una delle forme più comuni di ritardo mentale femminile. È dovuta a una mutazione a carico del gene MeCP-2, localizzato sul cromosoma X, che codifica per la methyl-CpG binding protein 2, la quale agisce da repressore trascrizionale che riconosce sequenze metilate reprimendo in modo specifico alcuni geni neuronali: in mancanza di MECP-2, si ha una anomala espressione genica che provoca gravi danni al SNC.

Acetilazione degli istoni

Gli istoni sono proteine basiche (ricche di residui di lisina e arginina) che costituiscono la componente strutturale della cromatina (a sua volta costituita da DNA, RNA e, appunto, proteine). Gli istoni, carichi positivamente, interagiscono con il DNA, carico negativamente per l’abbondanza di gruppi fosfato, a formare strutture dette nucleosomi, che sono le unità fondamentali della cromatina. Il ruolo fondamentale degli istoni è quello di organizzare il DNA, compattandolo in maniera ordinata così da consentire alle cellule di conservarlo in un volume ristretto come quello del nucleo.

Tuttavia, gli istoni sono coinvolti anche nel controllo epigenetico dell’espressione genica:

• L’acetilazione degli istoni ad opera dell’enzima istone acetil-transferasi opera un controllo positivo dell’espressione genica; ad esempio, nei precursori dei globuli rossi, che esprimono la globulina, il gene codificante per la globulina è acetilato;
• La deacetilazione degli istoni ad opera dell’enzima istone deacetilasi opera un controllo negativo dell’espressione genica; questo accade perché la deacetilazione degli istoni comporta una compattazione della cromatina che impedisce l’accesso dei fattori di trascrizione; riprendendo l’esempio della globulina, negli epatociti, che non esprimono la globulina, il gene codificante per la globulina è deacetilato.

RNA interference

RNA interference è un meccanismo attraverso il quale alcuni corti frammenti di RNA non codificante a doppio filamento sono in grado di interferire negativamente con l’espressione genica. L’enzima taglia questi frammenti dando microRNA di 19-21 paia di basi detti siRNA (short interfering RNA).

Il siRNA, a questo punto, si associa con un complesso enzimatico che apre il doppio filamento: il filamento senso viene degradato, mentre il filamento antisenso rimane associato al complesso enzimatico. Dopodiché, il complesso enzimatico attivo scansiona gli mRNA presenti nel citoplasma fino a trovarne uno complementare al filamento antisenso: se l’appaiamento è perfetto, l’enzima opera un taglio sull’mRNA target e il frammento ottenuto viene degradato da RNAasi, senza essere tradotto.

Questo processo, noto come silenziamento dell’RNA, è stato recentemente proposto come strategia antitumorale: se abbiamo una proteina anomala responsabile della comparsa del tumore, tramite questa tecnica è possibile impedire l’espressione di quella proteina. È stato inoltre ipotizzato un coinvolgimento dei microRNA nell’insorgenza di neoplasie: in mancanza di un certo numero di microRNA, infatti, si ha una iperespressione di determinati geni.

Controllo della proliferazione cellulare

Secondo una classificazione messa a punto dal medico italiano Giulio Bizzozzero alla fine dell’Ottocento, le cellule si distinguono in tre tipologie a seconda della loro capacità proliferativa:

• Cellule perenni: Sono cellule incapaci di proliferare, quindi dette terminalmente differenziate. Si possono a loro volta distinguere in cellule incapaci di replicare il DNA, come ad esempio i neuroni, le cellule del Sertoli - cellule di sostegno che si trovano nel connettivo che circonda i tubuli seminiferi dei testicoli -, gli adipociti e le cellule del cristallino, oppure cellule capaci di replicare il DNA ma comunque non di dividersi e proliferare, come le cellule del muscolo striato e del miocardio; qui possono essere presenti cellule aventi un numero di cromosomi diverso da 2N - 46 cromosomi - bensì pari a un multiplo corretto - 4N, 8N, 16N; si parla in questo caso di euploidia, cioè di ploidia corretta, dove per ploidia si intende il numero di serie omologhe N di cromosomi presenti in una cellula: una cellula con una sola serie di cromosomi avrà ploidia 1 (1N) e si dirà dunque aploide.
• Cellule stabili: Sono cellule caratterizzate da un tasso mitotico molto basso: sono, cioè, cellule normalmente a riposo ma che, stimolate, possono andare incontro a un’ondata di rigenerazione. Ne sono esempi gli epatociti, i fibroblasti, le cellule dell’endotelio e le cellule del muscolo liscio.
• Cellule labili: Sono cellule che continuano a replicarsi per tutta la loro vita. Ne sono esempi le cellule del midollo osseo e le cellule della maggior parte degli epiteli.

Più importante è la classificazione delle cellule proposta da Cowdry negli anni Cinquanta:

• Cellule post-mitotiche fisse (perenni): Sono cellule nelle quali non si osserva mai mitosi; ne sono esempi i neuroni, i cheratinociti, le cellule muscolari striate, i granulociti polimorfonucleati.
• Cellule post-mitotiche revertanti (stabili): Sono cellule nelle quali si osservano rare mitosi, che tendono ad aumentare a seguito di stimolazione; ne sono esempi gli epatociti - l’asportazione del fegato, per esempio, innesca un’ondata rigenerativa che però è limitata: al termine, gli epatociti vengono sostituiti da fibroblasti e si va incontro a cirrosi epatica e insufficienza epatica -, le cellule renali, le cellule endoteliali, i fibroblasti e i linfociti.
• Cellule inter-mitotiche vegetative (labili): Sono cellule nelle quali si osservano frequenti mitosi.