Nutrizione e crescita microbica

MICRONUTRIENTI

FERRO: Ha un ruolo fondamentale nella respirazione cellulare. È il

 componente chiave dei citocromi e delle proteine ferro-zolfo.

POTASSIO E MAGNESIO: Elementi fondamentali per tutti gli organismi.

 Il potassio è richiesto da molti enzimi mentre il magnesio stabilizza le

membrane cellulari, i ribosomi e gli acidi nucleici.

FATTORI DI CRESCITA: Sono micronutrienti organici. Comuni fattori di

 crescita comprendono le vitamine, amminoacidi, purine, pirimidine ecc..

In genere le vitamine sono i fattori di crescita più richiesti, in

particolare dai batteri lattici. Gli organismi ai dividono in.

a) PROTOTROFI: sintetizzano tutti i componenti necessari a partire

da una fonte di carbonio o precursori iorganici

b) AUXOTROFI: devono necessariamente acquisire fattori di crescita

dall’ambiente circostante (purine, pirimidine, aminoacidi, vitamine,

precursori)

La qualità e la quantità di nutrienti che un microrganismo ha a disposizione

influiscono profondamente sulla crescita microbica.

La cattura dei nutrienti è limitata dalla permeabilità della membrana

citoplasmatica. Il trasporto può avvenire secondo gradiente o contro

gradiente ed essere quindi passivo o attivo. (vedi pdf capitolo 2)

Oltre ai nutrienti servono altre condizioni ambientali, chimiche e fisiche

compatibili con la crescita:

O2

 pH

 temperatura

 disponibilità di acqua



I microrganismi possono essere raggruppati in base alle condizioni richieste

per la loro crescita:

 AEROBI: utilizzano O2 (come accettore terminale di elettroni)

 ANAEROBI: non necessitano di O2

Obbligati: crescono in completa assenza di ossigeno;

Facoltativi: crescono in presenza di ossigeno;

Aerotolleranti: non utilizzano l’ossigeno nei loro metabolismo

energetico ma possono crescere in sua presenza;

MICROAEROFILI: atmosfera ridotta, O2 è tossico ad alte

 concentrazioni

L’ossigeno può essere tossico! L’interazione di

O2 con enzimi cellulari durante i processi di

riduzione ad acqua può generare composti

molto reattivi e tossici (ROS). Le specie

reattive all’ossigeno sono forti ossidanti:

inducono la formazione a catena di radicali

liberi danneggiando molecole della cellula (lipidi,

DNA).

Gli organismi aerobi o aerotolleranti hanno

sviluppato sistemi diversi di detossificazione

che difendono la cellula dagli effetti dannosi

delle specie reattive dell’ossigeno.

Detossificazione di

radicali dell’ossigeno:

L’attività congiunta di

catalasi e superossido

dismutasi converte l’anione superossido in O2.

NEUTROFILI: pH 5,5-8,5

 ACIDOFILI: pH <5,5 in questo gruppo ritroviamo anche gli acidofili

 obbligati che vivono esclusivamente a PH acido;

ALCALOFILI: pH>8,5

 PSICROFILI: <10°C adatti a vivere a basse

 temperature poiché quelle alte sono

letali;

ESTREMOFILI: che crescono in maniera

 ottimale sia a temperature basse che

elevate;

MESOFILI: 10-55

 °C

TERMOFILI: 55-80

 °C

IPERTERMOFILI: 80-120

 °C

 NON ALOFILO: richiedono un’elevata disponibilità di acqua;

 ALOTOLLERANTE: Riescono a tollerare una certa diminuzione dell’acqua

anche se crescono in maniera ottimale a bassa concentrazione di soluti;

 ALOFILO (ambienti marini, 3% NaCl) sono adatti ad una vita con elevata

presenza di concentrazione dissoluti

 ALOFILO ESTREMO (15-30% NaCl) crescono a concentrazioni di soluti

molto elevate e vicine alla saturazione;

Per coltivare i microrganismi è necessario lavorare in condizioni sterili,

necessario per ottenere colture pure. Perciò sono necessarie:

STERILIZZAZIONE: distruzione o eliminazione di tutte le forme viventi,

 siano esse animali o vegetali, macroscopiche, microscopiche,

submicroscopiche, innocue o nocive;

DISINFESTAZIONE : eliminazione degli agenti capaci di causare infezione

 o malattia.

Per fare questo si possono usare:

METODI FISICI METODI CHIMICI

calore antisettici

 

radiazioni disinfettanti

 

filtrazione conservanti

  antibiotici



FIAMMA DEL BUNSEN: Alla fiamma del Bunsen si può sterilizzare la

1. superficie esterna delle provette o beute. Esercita un’azione germicida

nell’aria intorno alla fiamma per un raggio di pochi cm, creando una zona

sterile. Alla fiamma del Bunsen è anche possibile sterilizzare l’ansa o l’ago

prima dei prelievi.

Gli oggetti da sterilizzare possono:

essere inseriti nella fiamma (impieghi molto limitati)

 essere solamente arroventati

 STUFA

2. a) AUTOCLAVE: E’ un dispositivo che utilizza il

vapore sotto pressione per uccidere i

microrganismi. Alla pressione di 1 atm il vapore

raggiunge una temperatura di 121°C alla quale le più resistenti spore

batteriche vengono distrutte in circa 15 min. impieghi: oggetti di gomma,

garze, terreni di coltura in brodo o agarizzati, purchè privi di sostanze

reperibile alle alte temperature.

Il liquido o il gas viene fatto passare attraverso un filtro con pori

sufficientemente piccoli: 0,45 –0,2 micrometri. Tuttavia non riescono a

trattenere i virus!

RAGGI ULTRAVIOLETTI (UV): Prodotti da lampade a vapori di mercurio

 (lunghezza d’onda 200-300 nm). Possono causare danni al DNA e causare

la morte dei microrganismi. L’UV dotato di massima azione microbicida

ha una lunghezza d’onda di 260 nm.

a) limiti: azione lesiva sulla cute e sulle mucose

b) uso: sterilizzazione aria e piani di appoggio in ambienti protetti

RAGGI GAMMA: Prodotte da cobalto 60 e Cesio 137. Radiazioni

 “ionizzanti”: effetto mutagenico sul DNA. Sono molto pericolose,

necessitano di impianti costosi per il loro contenimento. Sono impiegate

per la sterilizzazione di materiali sanitari confezionati. Sono applicate

anche in campo alimentare.

Sono agenti chimici che provocano la morte dei microrganismi, ma non

necessariamente delle spore. Sono usati per disinfettare oggetti inanimati.

Spesso chiamati germicidi, sono composti chimici che inibiscono la crescita o

uccidono microrganismi. Sono sufficientemente poco tossici da poter essere

usati su tessuti viventi.

I terreni di coltura sono soluzioni di nutrienti usate per far crescere i

microrganismi in laboratorio.

Affinchè la coltura abbia successo occorre prestare particolare attenzione

alla sua preparazione. Esistono diversi terreni di colture:

TERRENI DEFINITI: sono preparati aggiungendo all’acqua distillata a

 quantità definite di sostanze inorganiche o organiche. Pertanto di un

terreno definito è nota la l’esatta composizione. Qualunque sia il

terreno la fonte di carbonio riveste particolare importanza.

TERRENI MINIMI: si tratta di terreni chimicamente definiti che

 contengono il minimo numero di sostanze indispensabili per la crescita

di una specie microbica;

TERRENI COMPLESSI: per la coltivazione di alcuni microrganismi non è

 essenziale conoscere l’esatta composizione del terreno e può risultare

vantaggioso usare questo tipo di terreno. Nei terreni complessi si usano

come fonte di nutrimento derivati della digestione di prodotti di origine

microbica come caseina, carne, semi di soia ecc... Lo svantaggio è che

non si conosce l’esatta composizione del terreno.

TERRENO ARRICCHITO: per microrganismi particolarmente esigenti e

 spesso patogeni si usa un terreno arricchito, derivante dal terreno

complesso a cui vengono aggiunti nutrienti come siero e sangue.

TERRENO SELETTIVO: contengono composti che inibiscono la crescita di

 alcuni microrganismi ma non di altri.

TERRENO DIFFERENZIALE: è un terreno in cui viene aggiunto un

 indicatore, di solito un colorante che attraverso il cambiamento di

colore rivela se è avvenuta una particolare reazione metabolica

durante la crescita. Questa coltura è usata perciò nella diagnostica

clinica.

I terreni di coltura solidi, sono terreni particolari, poiché oltre ai nutrienti

necessari contengono anche una sostanza gelificante molto usata per la

coltivazione in laboratorio. Quando una cellula è posta su un terreno di

cultura solido, moltiplicandosi un numero elevato di volte darà origine a un

insieme di cellule, visibile ad occhio nudo, chiamato “colonia”.

L’agente solidificate maggiormente utilizzato è l’agar un polimero di D-

galattosio, L-galattosio e acido D-glucuronico estratto dalle alghe rosse.

L’uso diffuso è dovuto ad alcuni sue caratteristiche fondamentali:

Una volta sciolta ad alta temperatura rimane liquida per temperature

 superiori ai 45 mentre forma un gelo per temperature inferiori;

°,

Quando si è solidificato, il gel rimane solido anche per temperature

 superiori a 45 °;

Rappresenta un substrato inerte che non va ad alterare le

 caratteristiche nutrizionali del terreno;

La crescita dei microrganismi non altera le



caratteristiche chimico-fisiche del gel;

Per preparare un terreno solido l’agar è aggiunto

sotto forma di polvere ha un terreno liquido e la

sospensione ottenuta è sterilizzata termicamente.

Questo trattamento comporta anche lo

scioglimento della polvere di agar nel terreno che può

quindi essere aliquotato in capsule di Petri o in

provette prima che si solidifichi. Per inoculare terreni solidi si fa uso di anse

o spatole che permettono la distribuzione delle cellule microbiche sulla

superficie (piastramento). Una tecnica alternativa è il piastramento per

inclusione, effettuato inglobando i batteri all’interno del terreno agarizzato

prima che si solidifichi. Questi terreni

permettono di isolare

agevolmente i coloni

puri derivati da

un’unica cellula iniziale,

che possono essere

mantenuti

indefinitamente e

utilizzati per inoculare

terreni solidi o liquidi e

produrre colture

pure. In cultura

liquida invece l’isolamento di linee pure è più complesso perché richiede

procedure adeguate per garantire che solo una coltura sia nell’inoculo.

Le colonie batteriche possono essere di misura e forme diverse a seconda

della specie, del terreno e delle condizioni di crescita. Alcune volte un terreno

può essere preparato utilizzando una quantità inferiore di agar e in tal caso

viene chiamato agar soffice.

Metodi di misura della crescita batterica:

a) misura del peso (biomassa): peso umido o peso secco

b) conta al microscopio: camera di Petroff-Hauser

c) contaggio vitale in piastra: UFC (unità formati colonia)

d) metodi turbidimetrici: torbidità, assorbanza

Uno dei metodi più comuni è la dete