Nutrigenomica

STRUTTURA DEI GENI PER miRNA

Ad oggi si ritiene che il numero di geni per miRNA rappresenti tra lo 0,5 e l'1% del numero di geni codificanti per proteine. Alcuni geni per miRNA sono isolati, altri ancora sono organizzati in cluster. Inoltre questi geni vengono espressi sotto il controllo di un proprio promotore (grazie all'attività della RNA pol II) e nel caso dei cluster questi sono espressi come trascritti policistronici soggetti a maturazione.

È stato osservato però che alcuni geni per miRNA sono localizzati all'interno di altri geni, sia a livello degli introni che a livello delle regioni esoniche. Questi geni possono essere codificanti per proteine o per lncRNA (long non coding RNA); in questo caso i geni per miRNA non vengono espressi grazie ad un promotore proprio ma a partire dal quello del gene all'interno del quale si trovano: il processo di maturazione del trascritto porterà alla liberazione dei miRNA.

Quello a fianco è

Un esempio del primo prodotto di trascrizione di un cluster di geni per miRNA - primary miRNA:

- Le sequenze in verde costituiscono le sequenze dei miRNA maturi all'interno di un precursore molto lungo noto come trascritto primario o pri-miRNA.

- È evidente che il trascritto primario presenta una serie di strutture secondarie a livello delle quali le sequenze dei miRNA maturi sono appaiate con altre regioni di sequenza del trascritto primario (presenza di sequenze ripetute e invertite).

- Il trascritto primario va incontro a maturazione per mezzo di una serie di tagli compiuti da complessi enzimatici con attività RNAsica Drosha e Dicer.

Nella figura sottostante, è schematizzato il processo di maturazione e azione dei miRNA:

- In rosa è indicato il nucleo, all'interno del quale il cluster di geni per miRNA (o un gene per miRNA isolato) va incontro al processo di trascrizione; il prodotto della trascrizione è un primary miRNA, indipendentemente dal

fatto che sia stato trascritto un gene singolo o un cluster. Nel nucleo agisce il primo complesso enzimatico, Drosha, che effettua dei tagli (processo di cropping) alla base delle regioni a forcina del pri-miRNA si tratta però di tagli asimmetrici che consentono la formazione di estremità sporgenti; - il miRNA precursore (o pre-miRNA) viene trasportato nel citoplasma grazie all'azione di specifici complessi proteici localizzati a livello della membrana nucleare (exportina 5), in modo da poter continuare il processo di maturazione. - Qui, il complesso enzimatico Dicer effettua tagli asimmetrici alla base della regione ad ansa del pre-miRNA (processo di dicing), formando un miRNA duplex, ovvero due filamenti complementari di RNA che possiedono ciascuno un'estremità 3' sporgente. - A questo punto, una sola delle due eliche del miRNA duplex verrà poi selezionato per fungere da miRNA e la selezione dipende dalle caratteristiche delle

estremità sporgenti al 3’, dalla sequenza insè e da quale proteina della famiglia Argonauta (AGO) entrerà a far parte della composizione delcomplesso RISC.

Il filamento del duplex che viene eliminato prende il nome di miRNA* (miRNA star).

L’altro filamento verrà inglobato nel complesso ribonucleoproteico RISC (complesso silenziatoreindotto da RNA), il quale interagisce con il mRNA target grazie alla complementarietà tra miRNA emRNA.

L’mRNA potrà quindi subire un blocco della traduzione o essere indirizzato verso la degradazione.

MECCANISMO DI AZIONE DEI miRNA:

i miRNA riconoscono il sito d’azione attraverso la complementarietà tra le proprie basi e quelle dell’mRNAtarget;

la regione 5’ del miRNA viene definita REGIONE SEME e si estende dalla posizione nucleotidica 2 alla8: questa è fondamentale per il legame del complesso RISC all’mRNA bersaglio dal momento chetale regione presenta un

appaiamento perfetto all'mRNA bersaglio.- La regione al 3' del miRNA invece può appaiarsi con l'mRNA target in maniera imperfetta, riconoscendo una regione parzialmente complementare: in tal caso il miRNA induce una repressione traduzionale (inibizione dell'espressione genica reversibile); se l'appaiamento con l'mRNA invece avviene in maniera perfetta, questo induce una degradazione dell'mRNA target (inibizione dell'espressione genica irreversibile); Questo vale per l'azione dei miRNA negli animali Meccanismi di repressione della traduzione: La repressione traduzionale può avvenire a diversi livelli: è possibile che ciascun miRNA abbia uno specifico meccanismo d'azione. Ricordando le fasi del processo di inizio della traduzione: tra i fattori di inizio della traduzione (eIF) alcuni si legano alla subunità minore, altri al cap al 5' (innesco del processo di scansione), altri ancora.mantengono alcuni miRNA possono legarsi direttamente all'mRNA bersaglio, impedendo la sua interazione con il fattore di traduzione eIF4E e quindi bloccando la traduzione.➔ Inoltre, alcuni miRNA possono regolare l'espressione dei fattori di traduzione stessi, influenzando così la loro disponibilità e attività durante il processo traduzionale.

Il blocco della traduzione può avvenire anche per competizione, in quanto il dominio centrale di AGO è simile al fattore di inizio eIF4E (che lega il cap).

AGO può inoltre reclutare eIF6, un fattore di traduzione che impedisce che la subunità maggiore 60S si leghi alla subunità minore 40S.

Inoltre, il complesso RISC (e quindi il miRNA) è in grado di provocare un blocco durante la fase di allungamento della traduzione promuovendo il distacco prematuro dei ribosomi in fase di elongazione.

Ancora, è stato osservato che in alcuni casi il complesso RISC non determina un vero e proprio blocco della traduzione, quanto invece la degradazione della catena polipeptidica nascente proprio durante il processo di sintesi.

Inoltre, la coda di poli-A degli mRNA eucariotici è legata da copie multiple della proteina PABPC1, la quale interagisce con il fattore di inizio eIF4G che fa da ponte con il cap al 5' (perché eIF4G è

legato aeIF4E). Grazie all'interazione proteina-proteina, l'mRNA va incontro a circolarizzazione, in quanto la coda di poli-A viene così a trovarsi in vicinanza al cap al 5': la circolarizzazione permetterà dunque al ribosoma che ha appena terminato il processo di traduzione, di essere nuovamente reclutato, permettendo immediatamente un secondo ciclo di traduzione dello stesso mRNA.

Alcuni miRNA impediscono proprio questo processo di pseudo-circolarizzazione dell'mRNA andando ad accorciare la coda di poli-A (deadenilazione) provocando anche il rilascio delle copie della proteina PABPC1. Altri miRNA provocano la destabilizzazione degli mRNA, rimuovendo il cap e accorciando la coda di poli-A, indirizzandoli alla degradazione.

Non si esclude che i miRNA siano in grado di agire stimolando in parallelo più meccanismi.

I micro RNA sono regolatori negativi post-trascrizionali dell'espressione genica:

- per azione di un miRNA si ha la creazione di

un circuito di regolazione: non esiste una regolazione 1 a 1, nel senso che un singolo miRNA non regola un singolo mRNA, ma un miRNA può avere come bersaglio centinaia di mRNA, in quanto possono esistere più mRNA che presentano regioni di complementarietà con un singolo miRNA; è però anche vero il contrario: se prendiamo in considerazione un singolo mRNA, esso potrà presentare siti di complementarietà con più miRNA diversi sia nella regione 3'-UTR, sia nella porzione coding (nella ORF); dunque un singolo mRNA può essere controllato da più tipi di miRNA "RETE REGOLATORIA".

RICORDA: Il miRNA si lega per complementarietà al mRNA bersaglio e, in funzione del tipo di complementarietà al di fuori della "seed region", si ha repressione traduzionale o degradazione del mRNA bersaglio.

LONG NON-CODING RNA O lncRNA

• Hanno una lunghezza maggiore di 200 nucleotidi;
• Possiedono un

cap al 5’ e una coda di polyA e possono andare incontro al processo di splicing;

Sono stati scoperti grazie alle nuove tecniche di sequenziamento massivo e ad alto coverage;

I livelli di espressione di solito sono minori rispetto a quelli degli mRNA e per questo motivo considerati inizialmente come un rumore di fondo della trascrizione pervasiva.

Si osservò però che questi trascritti sono soprattutto tessuto- o cellula-specifici e i loro livelli di espressione variano in tessuti diversi, durante lo sviluppo o durante il differenziamento cellulare: molti lncRNA sono specifici del sistema nervoso e dei primati.

Alcuni di questi lncRNA hanno caratteristiche di trascritti anti-senso (ovvero il trascritto esattamente complementare a quello dell’mRNA) che regolano i trascritti di senso.

Possono essere codificati da introni di altri geni.

Alcuni di questi, se sottoposti a particolari processi di maturazione, possono dare origine a microRNA, asnoRNA (piccoli)

RNA nucleolari) e piwiRNA. MECCANISMO D’AZIONE DEI lncRNA: ➔ Questi lncRNA possono agire nel nucleo (prima o nel momento della trascrizione); ➔ Altri agiscono nel citoplasma, dando una regolazione di tipo post-trascrizionale; ➔ possono inoltre agire o "in cis" ovvero sul locus da cui sono stati prodotti (come nel caso del trascritto Xist prodotto dai cromosomi X di mammifero, uno dei quali viene convertito in una massa di eterocromatina chiamata corpo di Barr; Xist e l'antisenso Tsix agiscono in cis in quanto esplicano la propria funzione sullo stesso cromosoma da cui sono prodotti) o in trans, influenzando geni e trascritti prodotti sintetizzati da regioni del genoma lontane da quelle che hanno portato alla sintesi di questi lncRNA. Possono svolgere la loro funzione agendo: ➢ Come "GUIDA per il riconoscimento della molecola bersaglio mediante la complementarietà delle basi ➢ Come "SCAFFOLD", ovvero come una struttura portante a cuisi legano specifiche proteine
Inoltre conse